Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em> Listeria monocytogenes</em
概要
Listeria monocytogenes sıklıkla hücre içi asalaklığın çalışma için büyük bir model olarak kullanılan bir Gram pozitif bakteri patojendir. Geç L. Görüntüleme küçük müdahale edici RNA ekranlar bağlamında enfeksiyon aşamaları monocytogenes, hedef konakçı hücrelerin bakteriyel bir enfeksiyon için gerekli hücresel yolların küresel çalışma sağlar.
Abstract
Bakteriyel hücre içi patojenler zarif işlemek ve ana hedef dokuların enfeksiyonu için gerekli olan hücre fonksiyonlarını yıkmak için kendi kapasitesi nedeniyle hücresel sinyal kaskadlar incelemek için moleküler araçlar olarak tasavvur edilebilir. Bu bakteriyel patojenler arasında, Listeria monocytogenes hücresel bağışıklık tepkilerinin karakterizasyonunda hücre içi parazitlenme için bir paradigma olarak kullanılan bir Gram pozitif mikroorganizma ve hücre iskeleti ve membran ticareti dinamiklerini kontrol moleküler yollarının bulunması etkili rol oynamıştır. Bu yazıda, L. geç hücre enfeksiyonu aşamalarının saptanması için bir tahlili tarif sağlam mikroskobik monocytogenes inlc, enfekte olmuş hücrelerin sitoplazması içinde biriken bir salgılanan protein bakteriyel floresan etiketleme göre, bu deney, Char için otomatik yüksek verimli, küçük müdahale edici RNA ekranlara bağlanabilirenfeksiyon yukarı-veya aşağı-regülasyonunda rol oynayan hücresel sinyal yolları acterize.
Introduction
Gram pozitif bakteri Listeria monocytogenes, konakçı hücreleri işgal onun içselleştirme vakuol bozar ve konakçı hücreler 1 sitoplazması içinde replike olan bir gıda kaynaklı patojendir. L. hücre ve hayvan modellerinde görülen bakteriyel hastalık özelliklerin kalıcılığı ile ilişkili laboratuar bağlamında (hızlı büyüme, sağlıklı bireyler için düşük toksisite) manipülasyon kolaylığı monocytogenes (hemolitik aktivite, lökositoz) için önemli bir model olarak 1960 yılında ilk kullanım izin hücre içi asalaklık ve enfeksiyondan 2 karşı hücresel bağışıklığın teorik temellerinin kurulması için çalışma. 1980'lerin sonu ve 1990'ların başlarında, bakteri hücre içi döngüsü 3 yanı sıra en önemli bakteriyel virulans moleküler karakterizasyonu diseksiyonu 4-7 L. kullanımını tercih faktörleri manipülasyon ve damızlık için önemli bir moleküler araç olarak monocytogeneskonakçı hücre fonksiyonlarının y. Listeria cinsinin Avirulent varlığı (L. innocua) ve öldürücü (L. monocytogenes) türleri karşılaştırmalı genomik çalışmalar 8 önünü açtığını, birlikte tam L. son kurulması ile monocytogenes L. evrim anlayışımızı artış, 9 transcriptome bir insan patojeni olarak ve enfeksiyonu için bir model sistem olarak monocytogenes 10 çalışmalar.
L. monocytogenes ev sahibi hücre reseptörleri, sırasıyla E-kadherin ve Met, 11-12 ile bakteriyel yüzey proteinleri ve InlA ınlB etkileşimi üzerine konakçı hücreler içine içselleşmesini uyarır. Başlangıç aday bazlı çalışmaları ınlB-kritik bir effektör olarak InlA istilası yolunun 13 ve fosfoinositid 3-kinaz (PI 3-K) önemli bir bileşeni olarak α / kateninler β-aktin bağlantı tanımlanmasına yol açtı bağımlı işgali Cascade 14-15. Proteomik ve fonksiyonel bazlı deneyler sonradan izin roman sitoskeletal elemanları 16 ve konakçı hücre işgali için gerekli lipid ikinci haberciler 17 tanımlama. Transkripsiyonal çalışmalar 18 ve kütle spektrometresi tabanlı nicel proteomiks 19 Yakın zamanlarda sinyal şelaleden aktivasyonu ve L. sırasında bağışıklık tepkilerinin baskılara ilişkin yeni bir ışık tutmuştur monocytogenesin. Sistem biyolojisi küçük müdahale RNA genlerin (kinomes, tam genomları) büyük setleri inaktive dayalı yaklaşımlar (siRNA) susturulması son zamanlarda fagositozundan dahil, spesifik hücresel fonksiyonları bağlamında sinyal basamaklarının küresel ana analizi için yeni yollar açtı ve var patojen içselleştirilmesi 20. Genom siRNA'nın ekranlar önceden L. enfeksiyonu için gerekli hücresel kaskadlar araştırmak için yapılmıştır fagositik Drosophila monocytogenes </em> S2 hücreleri 21-22 ancak bu tip analiz fagositik olmayan hücrelerde gerçekleştirilen edilmemiştir, in vivo enfeksiyonu için önemli hedefleri temsil eder.
Biz, L. tarafından enfeksiyonun geç aşamalarında mikroskobik tespiti için bir protokol optimize epitel hücre içinde bakteri giriş yüksek verimli siRNA çalışmaları için uygundur monocytogenes. Bizim deney oldukça invazif L. yararlanır PrfA, L. majör kopyalama düzenleyicisi olarak, bir nokta mutasyon sunulur gerginlik monocytogenes 6, hastalık oluşturma faktörleri monocytogenes (PrfA * olarak adlandırılır) bu mutasyon 23 PrfA kurucu bir şekilde etkin hale getirir ve bu yüzden başka türlü kötü enfekte fagositik olmayan hücrelere bakteriyel girişi lehine, istila protein InlA ve ınlB bir artış çıkmasına yol açar. Enfeksiyon Bizim okuma salgılanan bakteriyel protein inlc sitozolik birikiminin saptanması üzerine dayanmaktadır: Bu molekülintra-sitoplazmik L. tarafından tercihen eksprese edilen bir pleiotropik efektör monocytogenes 9 ve katılır bakteri hücreden hücreye yayılan 24 değil, aynı zamanda konak immün yanıtları modüle 25, bunlar sadece. Hücre içi bakterilerin inlc salgılanmasının floresan etiketleme açıkça enfekte olmayan hücrelerin enfekte ayırt etmesine olanak veren, aynı zamanda, bir uç-nokta, daha sonra, farklı adımlarda enfeksiyon incelemek için kullanılabilir okuma temsil eder, sadece: girişi, vakuolar kaçış, sitosolik bakteriyel çoğalması ve hücre-hücre yayıldı. Bu mikroskopi tabanlı protokol Bu nedenle L. tarafından konak hücrelerin enfeksiyonu ile ilgili hücresel yolları okumak için siRNA ekranlara bağlanabilir monocytogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli parametre inlc sinyalinin kesin bir algılanmasına izin vermek için yeteri kadar büyük bir sitoplazma gösteren sağlıklı hücre çizgilerinin kullanımı da dahil olmak üzere inlc bilgi algılama protokolün başarısına için kritik öneme sahiptir. Deneyde biz nedeniyle sitosolik boşluğun genişletilmesi için tahlil için özellikle uygun olan HeLa CCL2 hücrelerin kullanımı önermek bu madde içinde mevcut bu tür Kyoto HeLa hücreleri gibi diğer HeLa klonlar daha küçük bir ekran ancak sit…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P. Cossart Araştırma laboratuvarında Pasteur Enstitüsü, Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), Agence Nationale de la Recherche (Grant Mie-tarafından desteklenmektedir SignRupVac), Louis-Jeantet Vakfı ve Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK Pasteur-Paris Üniversitesi Uluslararası Doktora Programı / Institut Carnot İlletler Infectieuses bir burs bir alıcı. Biz hücresel transfeksiyon protokolü optimize Jason Mercer teşekkür ederim.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
参考文献
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
- Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
- Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
- Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
- Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
- Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
- Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
- Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
- Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
- Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
- Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
- Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
- Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
- Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
- Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
- Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
- Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
- Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
- Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
- Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
