Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em> Listeria monocytogenes</em

Die Gram-positiven Bakterium Listeria monocytogenes ist ein Lebensmittel übertragbaren Krankheitserreger, der Wirtszellen eindringt, stört seine Internalisierung Vakuole und repliziert im Zytoplasma der Wirtszellen ^ein. L. monocytogenes Leichtigkeit der Manipulation im Labor Kontext (schnelles Wachstum, geringe Toxizität für gesunde Personen) mit dem Fortbestehen der in Zell-und Tiermodellen beobachtet bakteriellen Virulenz assoziiert (hämolytische Aktivität, Leukozytose) erlaubt seinen ersten Einsatz in den 1960er Jahren als Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus und für die Errichtung der theoretischen Grundlagen der zellulären Immunität gegen eine Infektion ^2. In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren, die Präparation der bakteriellen intrazellulären Zyklus ³ sowie die molekulare Charakterisierung der wichtigsten bakteriellen Virulenzfaktoren ^4-7 begünstigt die Verwendung von L. monocytogenes als Schlüssel molekulares Werkzeug für die Manipulation und Gestüty von Wirtszellfunktionen. Die Anwesenheit von avirulenten (L. innocua) und virulent (L. monocytogenes) Arten in der Gattung Listeria ebnete den Weg für die vergleichende Genomstudien ^8, die zusammen mit der jüngsten Gründung der komplette L. monocytogenes Transkriptom ^9, haben unser Verständnis der Evolution von L. erhöht monocytogenes als menschliche Krankheitserreger und als Modellsystem für die Infektion untersucht ^10.

L. monocytogenes induziert seine Internalisierung in Wirtszellen bei Wechselwirkung der bakteriellen Oberflächenproteinen InlA und InlB mit ihren Wirtszellrezeptoren E-Cadherin und Met, jeweils ^11-12. Anfängliche Kandidat-basierten Untersuchungen führten zur Identifizierung der α / β-Actin Cateninen Verbindung als wesentliche Komponente der InlA-Invasion Kanal ¹³ und der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3-K) als kritischer Effektor des InlB- abhängig Invasion cascade ^14-15. Proteom-und Funktionsbasierte Assays anschließend erlaubt die Identifizierung neuer Zytoskelett-Elemente ¹⁶ und Lipid-Second Messenger ¹⁷ für Wirtszellinvasion erforderlich. Transkriptions-Studien ¹⁸ und Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik ¹⁹ haben vor kurzem ein neues Licht über die Aktivierung von Signalkaskaden und Gastgeber der Unterdrückung von Immunreaktionen während L. monocytogenes-Infektion. Auf der Grundlage der Inaktivierung von großen Gruppen von Genen (kinomes, komplette Genome) von small interfering RNA Systembiologie (siRNA) Silencing haben vor kurzem neue Wege für die Analyse der globalen Wirt-Signalkaskaden im Kontext der spezifischen zellulären Funktionen, einschließlich Phagozytose geöffnet und Erreger Internalisierung ^20. Genomweite siRNA-Bildschirme haben bereits durchgeführt worden, um zelluläre Kaskaden zur Infektion von L. erforderlich untersuchen monocytogenes in phagocytic Drosophila </em> S2-Zellen ^21-22, doch diese Art der Analyse nicht in nicht-phagozytische Zellen durchgeführt wurde, die kritische Ziele für die Infektion in vivo darstellen.

Wir haben ein Protokoll für die mikroskopische Detektion der späten Stadien der Infektion durch L. optimiert monocytogenes, die für die Hochdurchsatz-siRNA-Studien von Bakterieneintrag in Epithelzellen geeignet ist. Unser Assay nutzt ein hochinvasiven L. monocytogenes-Stamm, der eine Punktmutation in PrfA, der Haupttranskriptionsregulator von L. präsentiert monocytogenes Virulenzfaktoren ^6: diese Mutation (benannt PrfA *) macht PrfA konstitutiv aktiven ²³ und führt zu einer erhöhten Expression der Proteine ​​Invasion InlA und InlB daher begünstigt bakterielle Eintrag in sonst schlecht nicht-infizierten Fresszellen. Unsere Auslese zur Infektion beruht auf dem Nachweis der Akkumulation des cytosolischen sezernierte bakterielle Protein InlC zugrunde: dieses Molekül isteine pleiotrope Effektor, der vorzugsweise durch intrazytoplasmatische L. exprimiert wird monocytogenes ⁹ und welche nimmt nicht nur in der bakteriellen Zelle-zu-Zelle verteilt ²⁴ aber auch Wirtsimmunantwort moduliert ^25. Die Fluoreszenzmarkierung InlC Sekretion von intrazellulären Bakterien ermöglicht nicht nur eine klare Unterscheidung infizierter von nicht-infizierten Zellen, sondern stellt auch eine Endpunktanzeige, die verwendet werden kann, um anschließend zu sezieren Infektion in verschiedenen Schritten: Eingabe vakuolären Flucht cytosolischen Bakterien Proliferation und Zell-zu-Zell-Ausbreitung. Dieses Mikroskopie-basiertes Protokoll kann siRNA Bildschirme gekoppelt werden daher zelluläre Signalwege bei der Infektion von Wirtszellen von L. beteiligt studieren monocytogenes.