Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração<em> In vitro</em

Este procedimento está de acordo com os Regulamentos do Reino Unido O Home Office (Lei procedimentos científicos animal, 1986). Os cientistas devem seguir as diretrizes estabelecidas e aprovadas pelos organismos reguladores animais institucionais e nacionais. 1. Dissecção e dissociação de Rato RMS Neuroblastos Preparar as soluções necessárias para a RMS e dissecção de dissociação: Meio de dissecção (100 ml) Equilibrado solução de Hank Sal (HBSS) – 98,5 ml 5 M de HEPES pH 7,4-0,5 ml Penicilina-estreptomicina (10.000 unidades / ml e 10.000 ug / ml) – 1 ml De meio de dissociação (2 mL) HBSS – 1.760 ml 10x de tripsina (2,5%) – 200 ul DNAse1 (1 mg / ml) – 40 ul Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) + 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS – 4 ml O meio completo (12 ml) Médias Neurobasal – 11,46 ml B27 Suplemento – 250 mL L-Glutamina (200 mm) – 125 mL Glucose (45%) – 165 ul 2. Filtrar-esterilizar a% de FCS + DMEM a 10 e meio completo e preequilibrate los num 37 ° C / 5% de CO2. Dissecação Sacrifique uma ninhada de ratos P6-P7 (cerca de 12 filhotes) por deslocamento cervical e decapitar com uma tesoura. Faça uma incisão ântero-posterior na pele ao longo da sutura médio-sagital do nariz para o cerebelo com uma lâmina de bisturi. Descasque a pele fora e repetir a mesma incisão ao longo do crânio. Remova cuidadosamente as abas cranianos com uma pinça e retire cuidadosamente o cérebro com uma espátula, tendo o cuidado de incluir os bulbos olfatórios. Corte o terceiro mais caudal do cérebro e descartá-lo. Pique ªe tecido cerebral em 1,4 milímetros de espessura, utilizando cortes coronais um helicóptero tecido. Coloque as fatias em pratos contendo meio de dissecção fria e cuidadosamente separá-los usando uma agulha. O RMS aparece como um triangular, a área translúcida no centro de seções OB e como uma pequena área circular em mais fatias cerebrais caudais. Corte as RMS fora de cada fatia com uma faca de microcirurgia, tomando cuidado para evitar a inclusão de tecido circundante. Em P7 filhotes de rato, geralmente as ~ 8 fatias mais rostral (incluindo OB) contêm os RMS. Colete os fragmentos RMS com uma pipeta Pasteur de plástico e coloque-os em um pequeno prato contendo meio de dissecção fria no gelo. Quando o esvaziamento está completo, os fragmentos de RMS transferir para um tubo de 15 ml com uma pipeta de plástico. Deixar fragmentos para assentar no fundo do tubo. Dissociação Substituir o meio de dissecção com 2 ml de meio de dissociação. Triturar os fragmentos RMS delicadamente pipetting a suspensão fragmento cima e para baixo cerca de 10x com uma pipeta P1000. Deixar o tubo com os fragmentos de tecido em um banho de água a 37 C ° durante 2 min. Pipetar a solução novamente 10x e assegurar que os fragmentos têm dissociado (a suspensão deve tornar-se turva). Inactivar a tripsina adicionando 5 ml de pré-aquecido DMEM + 10% FCS. Centrifugar a suspensão de células a 433 xg por 5 min. Na alíquota entretanto a quantidade necessária de siRNA / ADN em tubos de Eppendorf (habitualmente 3-5 ug de ADN / shRNA ou siRNA 5-9 oligo ug por nucleofection, no entanto, a quantidade de ADN / siRNA podem requerer optimização). Remover o excesso de meio e ressuspender o sedimento de células por pipetagem suave em 5 mL de pré-aquecido DMEM + 10% FCS. Realizar uma contagem de células. Esperar ~ 1 x 10 6 células por rato filhote cérebro. Um mínimo de 2,5 x 10 6 células são necessárias para cada nucleofection, enquantoos melhores resultados são obtidos usando 3-4 x 10 6 células por nucleofection. Centrifugar a suspensão de células a 433 xg por 5 min. Certifique-se de remover o máximo médio possível. 2. Nucleofection Imediatamente ressuspender o pellet celular em ratos (ou o mouse se estiver usando células de camundongo) solução nucleofection neurônio previamente incubada à temperatura ambiente. Use 100 ml por nucleofection Nota:. Normalmente uma ninhada de ratos de 12 filhotes é suficiente para realizar 4 nucleofections e uma ninhada de rato (12 filhotes) é suficiente para realizar 2 nucleofections. Transferir 100 ul da suspensão de células a cada tubo de Eppendorf contendo siRNA / ADN e misturar delicadamente 2-3x por pipetagem com pipeta P200. Adicionar a amostra (suspensão cell-DNA/siRNA) para a parte inferior do nucleofectioncuvette, tendo cuidado para evitar bolhas de ar. Nucleofect usando o programa de G-013 (para células de rato) ou O-005 (paracélulas de camundongo). Uma nucleofection leva cerca de 5 segundos. Rapidamente adicionar 1 ml de pré-aquecida de DMEM + FCS a 10% para a amostra nucleofected. Repita os passos 2.4 e 2.5 para todas as outras amostras. Nota: para melhores resultados, o procedimento nucleofection todo não deve durar mais do que 5 min. Transferir cada amostra para um tubo de 15 ml contendo 5 ml de pré-aquecido DMEM + 10% de FCS utilizando a pipeta de plástico fornecidos pelo estojo nucleofection. Evitar a transferência de quaisquer restos celulares para o tubo. Centrifugar as amostras a 433 x g durante 5 min. Retire com cuidado todas médio excesso e ressuspender o sedimento em 25-30 mL de pré-aquecido DMEM + 10% FCS, utilizando uma pipeta P20. Não use mais de 30 mL de meio. Pipetar a suspensão como uma queda para o lado interior de uma tampa de p35 prato. Inverter a tampa sobre o prato de p35 contendo 2 ml de meio completo (ver também a Figura 1). Deixar na incubadora (37 ° C / 5% de CO 2) durante pelomenos 5 horas e até 7 horas. Maior tempo de incubação permite melhor reaggregation de grupos de células. Transfira as gotas de suspensão da tampa para o meio completo no prato com uma pipeta P1000 com uma ponta de corte. Incubar a 37 ° C / 5% de CO2 por 24 horas para nucleofections de DNA e 48 horas para nucleofections siRNA / shRNA. 3. Incorporação Preparar meio completo (25 ml) e preequilibrate que a 37 ° C / 5% de CO 2 durante algumas horas. Retire as alíquotas congeladas da matriz da membrana basal de -80 ° C freezer e descongele no gelo no quarto frio. Para cada nucleofection preparar um prato 6 centímetros contendo até oito 13 milímetros coverlips estéreis. Coloque os pratos em uma caixa de gelo coberto com filme plástico. É importante manter as lamelas fresco para evitar a solidificação da matriz, durante o processo de incorporação. Para manter a umidade, coloque uma tira de tecido úmido dentro de uma 15 centímetros prato que wdoente ser usado para armazenar até três pratos seis centímetros contendo os neuroblastos incorporados. Adicionar meio completo para a matriz descongelada numa proporção de 1:3. Por exemplo, misturar 40 mL de meio completo com 120 mL de matriz por pipetagem. Esta quantidade de matriz é suficiente para a incorporação de agregados em oito 12 milímetros lamínulas. Transferir os cachos de células avaliação reagregada para um tubo de 15 ml e centrifugar a 433 xg durante 5 min. Remover o excesso de meio e ressuspender o sedimento em 10 mL de meio completo. Coloque 2 mL de suspensão agregado de células em cada lamela estéril e adicionar 18 mL de matriz / mistura meio completo. Use a ponta da pipeta para espalhar a matriz ao longo de toda a lamela. Colocar imediatamente o prato 6 centímetros contendo as lamelas em 15 cm de disco e deixar na incubadora (37 ° C / 5% de CO 2) durante 15-20 min. Quando a matriz tem solidificado, adicione delicadamente 5 ml de meio completo a cada seis centímetros tomada prato cuidado para empurrarpara baixo qualquer lamela flutuante com uma ponteira. Incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO2 para permitir que os neuroblastos migrar para fora dos agregados celulares. 4. 3D Migração Assay Preparar as soluções necessárias para a imunocoloração. Preparar a solução de bloco: Solução bloco Goat (50 ml) Tampão fosfato (PBS) – 5 ml Soro de cabra – 7,5 ml 10% de Triton X-100 – 1,5 ml BSA – 50 mg H2O – 36 ml Filtrar e armazenar a 4 ° C. Prepare a solução de fixação: Solução de fixação (100 ml) Paraformaldeído (PFA) – 4 g ATENÇÃO: sempre lidar com PFA sob um capuz Sacarose – 20 g (opcional) PBS até 100 ml Sobre uma placa quente e sob agitação constante, dissolve-se o PFA em 80 ml de PBS mantida a 65 ° C. Uma vez que a AFP se dissolveu, adiciona-se 20 g de sacarose. Ajustar o pH a7,4 (normalmente através da adição de ~ 60 mL de NaOH a 1 M por 100 mL de solução). Levar até um volume total de 100 ml com PBS. Imunocoloração Coloque lamelas numa placa de 24 poços. Lavar lamínulas com PBS 2x. Corrigir os agregados neuroblastos RMS com solução fixadora por 45 minutos em temperatura ambiente. Lavar lamínulas com PBS 3x (5 min / lavagem – em uma plataforma de balanço). Bloco para 30-60 min com solução bloco cabra. Dilui-se os anticorpos primários em solução de bloqueio de cabra e incubar durante a noite a 4 ° C. (Se desejar, faloidina fluorescente (1:400) e corante Hoechst (1:10.000) pode também ser adicionado à solução do anticorpo primário para visualizar actina filamentosa e núcleos). Lavar lamínulas com PBS 3x (5 min / lavagem). Dilui-se anticorpos secundários, em solução de bloqueio de cabra e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Enxágüe coverslips com PBS 3x (5 min / lavagem) Monte lamelas com meio de montagem fluorescente e deixar secar durante a noite à temperatura ambiente. Análise migração Capturar imagens de agregados neuroblastos fixos RMS com um microscópio fluorescente usando uma objetiva de 10X. Incluir uma barra de escala de uma imagem de amostra. Para configurar a escala para quantificação, medir a barra de escala na imagem selecionando a ferramenta "Reta" na barra de ferramentas ImageJ. Escolha a opção "Analisar" e clique em "definir a escala '. Na janela de escala definir a 'distância conhecida "e marque a caixa' global 'para manter as mesmas configurações para todas as medições. Use a ferramenta "linha segmentada" na barra de ferramentas ImageJ para medir a distância a partir da borda do agregado para o mais neuroblasto migraram em seis setores diferentes em torno de todo o agregado (Figura 3B). Considere apenas isolado agagregações perenes para análise. Calcule uma distância média de migração dos seis valores obtidos para cada agregado. Medir 10-20 agregados para cada condição em cada experimento e piscina independentes resultados de um mínimo de três experimentos independentes. Sempre inclua um controle nucleofection (eg. GFP ou um sh controle / siRNA).