Verrijking en zuivering van menselijke embryonale stamcellen door detectie van celoppervlakantigenen met behulp van de monoklonale antilichamen TG30 en GCTM-2
概要
We beschrijven het gebruik van de monoklonale antilichamen TG30 (CD9) en GCTM-2 voor de gecombineerde detectie van celoppervlakantigenen via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor de identificatie en verrijking van levende menselijke embryonale stamcellen (hESC) met behulp van positieve selectie en ook het gebruik van negatieve selectie om hESC’s uit een gemengde celpopulatie te zuiveren.
Abstract
Menselijke embryonale stamcellen (hESC) kunnen zichzelf voor onbepaalde tijd in vitrovernieuwen en met de juiste signalen kunnen worden geïnduceerd om te differentiëren in mogelijk alle somatische cellijnen. Gedifferentieerde hESC-derivaten kunnen mogelijk worden gebruikt in transplantatietherapieën voor de behandeling van een verscheidenheid aan celdegeneratieve ziekten. HESC-differentiatieprotocollen leveren echter meestal een mengsel op van gedifferentieerde doel- en off-target celtypen en resterende ongedifferentieerde cellen. Voor de vertaling van gedifferentieerde hESC-derivaten van het laboratorium naar de kliniek is het belangrijk om onderscheid te kunnen maken tussen ongedifferentieerde (pluripotente) en gedifferentieerde cellen en methoden te kunnen genereren om deze populaties te scheiden. Veilige toepassing van hESC-afgeleide somatische celtypen kan alleen worden bereikt met pluripotente stamcelvrije populaties, omdat resterende hESC’s tumoren kunnen induceren die bekend staan als teratomen na transplantatie. Hiertoe beschrijven we hier een methodologie om pluripotentie geassocieerde celoppervlakantigenen te detecteren met de monoklonale antilichamen TG30 (CD9) en GCTM-2 via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor de identificatie van pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs met behulp van positieve selectie. Met behulp van negatieve selectie met onze TG30/GCTM-2 FACS-methodologie konden we ongedifferentieerde hESC’s detecteren en zuiveren in populaties die een zeer vroege differentiatie ondergaan (TG30Neg-GCTM-2Neg). In een verdere studie, pluripotente stamcel-vrije monsters van gedifferentieerde TG30Neg-GCTM-2Neg cellen geselecteerd met behulp van ons TG30/GCTM-2 FACS protocol niet teratomen vormen eenmaal getransplanteerd in immuun-gecompromitteerde muizen, ter ondersteuning van de robuustheid van ons protocol. Aan de andere kant hadden TG30/GCTM-2 FACS-gemedieerde opeenvolgende passaging van verrijkte pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs geen invloed op hun vermogen om zichzelf in vitro te vernieuwen of hun intrinsieke pluripotentie. Daarom bieden de kenmerken van onze TG30/GCTM-2 FACS-methodologie een gevoelige test om sterk verrijkte populaties van hPSC te verkrijgen als input voor differentiatietesten en om potentieel tumorogene (of resterende) hESC uit derivatencelpopulaties te verwijderen.
Introduction
HPSC (hPSC) omvatten menselijke embryonale stamcellen (hESC) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hIPSC). HPSC kan zichzelf voor onbepaalde tijd vernieuwen in geschikte cultuuromstandigheden zonder hun vermogen te verliezen dat bekend staat als “pluripotentie”. Pluripotentie wordt gedefinieerd als het potentieel voor een cel om zich te onderscheiden in in wezen elke somatische cellijn, inclusief cellen die representatief zijn voor elk van de drie embryonale kiemcellagen. Het opmerkelijke potentieel van hPSC biedt een middel voor een grote verscheidenheid aan celgebaseerde toepassingen, waaronder therapeutische opties. Er zijn bijvoorbeeld aandoeningen met celdood en degeneratie, waarbij de normale functionaliteit van cellen in het menselijk lichaam wordt aangetast, zoals bij hartfalen, ruggenmergletsels, diabetes, de ziekte van Parkinson, sommige kankers en andere klinische pathologieën. Patiënten die aan deze aandoeningen lijden, kunnen mogelijk worden behandeld door gezonde en functionele somatische cellen te transplanteren die zijn afgeleid van hPSC in het laboratorium. De huidige hPSC-differentiatieprotocollen zijn echter niet 100% efficiënt en leveren een mix op van gedifferentieerde doel- en off-target celtypen, evenals resterende hPSC’s die geen differentiatie hebben ondergaan, in plaats daarvan blijven ze zichzelf vernieuwen1-3. De aanwezigheid van zelfs een klein aantal hPSC in een monster van van hPSC afgeleide somatische cellen bestemd voor transplantatie bij patiënten vormt een ernstig klinisch risico, aangezien deze cellen door hun inherente aard weefsels van alle drie de embryonale kiemlagen kunnen vormen, mogelijk in vivo een type tumor kunnen vormen dat bekend staat als een teratoom. Daarom kunnen alleen doelcelpopulaties waarvan is vastgesteld dat ze vrij zijn van pluripotente stamcellen als veilig worden beschouwd voor transplantatie bij patiënten. Er zijn verschillende benaderingen gerapporteerd om mogelijk de zuivering van resterende hPSC’s na differentiatie te bereiken (zie Polanco en Laslett4voor beoordeling ). We hebben eerder het gebruik gemeld van de monoklonale antilichamen TG30 (CD9) en GCTM-2 gekoppeld aan fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om pluripotente stamcellen te identificeren en te onderscheiden van cellen die een vroeg stadium van differentiatie ondergaan in culturen vanhESC-lijnen 5-7.
Een voordeel van het gebruik van antilichamen om celoppervlakantigenen te detecteren, is dat de doelcellen meestal levensvatbaar zijn na het binden en/of labelen van antilichamen. Daarom kunnen doelcellen worden verzameld na antilichaametikettering en opnieuw worden gecultiveerd voor uitbreiding en verdere toepassingen vóór transplantatie. Een voorbehoud voor celoppervlakantigenen uitgedrukt op hPSC is dat ze niet exclusief zijn voor het pluripotente stadium en in veel gevallen tijdelijk opnieuw worden uitgedrukt tijdens de ontwikkeling en daarom zullen worden gedetecteerd in sommige gedifferentieerde celtypen. Daarom, als het doel is om antilichamen te gebruiken om menselijke pluripotente cellen op te sporen en te zuiveren uit een monster van hPSC-afgeleide cellen, mogen geselecteerde antilichamen niet ook reageren met antigenen op de specifieke gedifferentieerde celtypen die bestemd zijn voor transplantatie. Helaas zijn er beperkte aantallen antilichamen die celoppervlakmarkers detecteren op live hPSC’s 4,waardoor de selectiemogelijkheden beperkt zijn. Bovendien hebben enkele studies erop gewezen dat detectie van één enkele celoppervlakmarker niet voldoende is om alle hPSC te elimineren, wat suggereert dat elke poging om alle hPSC pluripotente subpopulaties te elimineren, moet vertrouwen op methoden die twee of meer antilichamen gebruiken die verschillende epitopen detecteren, uitgedrukt door hPSC’s 9-10. Zoals hierboven vermeld, zijn alleen hPSC-afgeleide cellen die kunnen worden bepaald als pluripotente stamcelvrije celpopulaties geschikt voor menselijke transplantatie. Het bereiken van dit niveau van strengheid kan niet worden bereikt met een enkele doorgang door een antilichaamgemedieerde celsorteertechnologie. Herkweek van de verrijkte populatie van gedifferentieerde doelcellen en daaropvolgende rondes van celsortering kan nodig zijn om definitief pluripotente stamcelvrije monsters te verkrijgen.
In ons laboratorium hebben we twee hES-celoppervlakantistoffen, TG30 (CD9) en GCTM-2, uitgebreid gekarakteriseerd voor de detectie van levende pluripotente cellen. Onze studies hebben aangetoond dat gecombineerde detectie van zowel TG30 als GCTM-2 sterk correleert met de expressie van canonieke pluripotentie-geassocieerde genen in hESC-lijnen 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling heeft consequent aangetoond dat hESC-culturen een kwantitatieve continue gradiënt van TG30/GCTM-2 expressie 5-7vormen . We hebben willekeurig vier populaties (P) cellen binnen deze TG30/GCTM-2 gradiënt vastgesteld: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) en P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Onze karakterisering van deze P4-, P5-, P6- en P7-celpopulaties heeft aangetoond dat de P6- en P7-subfracties een groot aantal pluripotentie-geassocieerde genen uitdrukken en efficiënt stamachtige kolonies vormen wanneer ze na FACS 2-3worden herkweekt . Aan de andere kant drukken P4 -cellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) een groot aantal differentiatiemarkers uit en vormen ze de spontaan gedifferentieerde celtypen die typisch voorkomen in uitdijende culturen van hESC-lijnen 5-6. We hebben besloten om de potentialiteit van onze TG30/GCTM-2 FACS te testen voor de selectieve eliminatie van resterende hPSC’s na differentiatie in een vroeg stadium, en ook voor de verrijking van pluripotente stamcelpopulaties. Het hieronder beschreven protocol laat zien hoe gedifferentieerde P4 -cellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) na FACS kunnen worden verzameld en herculturen om het zuiveren van pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) te bereiken. Verder leggen we ook de verzameling en hercultuur van pluripotente P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) cellen uit om een verrijkte cultuur van pluripotente cellen te verkrijgen, die vervolgens kan worden gebruikt als een gedefinieerde inputpopulatie om mogelijk de efficiëntie en consistentie van differentiatietesten te verhogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de klinische context zijn gedifferentieerde somatische celtypen het uiteindelijke gewenste product voor transplantatie en therapeutische toepassingen, en hPSC zijn een zelfvernieuwende en schaalbare bron om die somatische cellen of hun voorlopers in het laboratorium te genereren. De aanwezigheid van resterende ongedifferentieerde hESC’s met een inherent potentieel voor teratoomvorming is een veiligheidsrisico bij het overwegen van hESC-afgeleide somatische cellen voor transplantatie bij patiënten. Voor een overzicht van deze en andere risico’s in verband met celtherapie zie Sharpe et al. 16 Om dergelijke toepassingen te realiseren, is het daarom absoluut noodzakelijk dat onderzoekers doelcelpopulaties willen genereren die ook pluripotent stamcelvrij zijn. Hiertoe tonen we hier aan dat het met behulp van onze TG30/GCTM-2 FACS-methodologie mogelijk is om te controleren op de aanwezigheid van pluripotente cellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) in een differentiërende celpopulatie en levensvatbare hESC-gedifferentieerde derivaten te verkrijgen die kunnen worden verrijkt en gehercultureerd post-FACS. Hoewel het niet mogelijk is om 100% pluripotente stamcelvrije monsters te verkrijgen met een enkele pas van ons protocol, kunnen verrijkte hESC-derivaten opnieuw worden gecultiveerd en na opeenvolgende passaging wordt 100% somatische celzuiverheid bereikt. De aangetoonde levensvatbaarheid van somatische cellen voor expansie na FACS maakt het mogelijk om voldoende cellen te produceren die geschikt zijn voor potentiële transplantatietherapieën.
De bemoedigende resultaten van deze pilotstudie brachten ons ertoe om een uitgebreider onderzoek uit te voeren met behulp van ons TG30/GCTM-2-protocol in een vergelijkende studie met verschillende door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) lijnen15. In die studie ontdekten we dat pluripotente stamcelvrije monsters verkregen met behulp van ons TG30/GCTM-2 FACS-protocol geen teratomen veroorzaakten bij transplantatie in immuunarme muizen. Daarom kunnen we vol vertrouwen stellen dat met het gebruik van dit in vitro protocol, vroege fase differentiatie celculturen bepaald om vrij te zijn van pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi cellen ontwikkelen geen teratomen in vivo. Dit ondersteunt sterk de robuustheid van onze test en biedt een mogelijke aanpak om het risico op teratoomvorming te elimineren voorafgaand aan het gebruik van hPSC-afgeleide cellen in klinische toepassingen.
Omgekeerd laten we ook zien dat de TG30/GCTM-2 FACS-test kan worden gebruikt om een pluripotente celpopulatie op te halen met een hoog expressieniveau van deze twee oppervlakteantigenen (TG30Hi-GCTM-2Hi). Eerdere studies hebben aangetoond dat TG30Hi-GCTM-2Hi cellen de hoogste correlatie vertonen met OCT4hi expressie en het hoogste aantal hESC-achtige kolonies vormen5,6,13,15. We redeneren daarom dat het pluripotentienetwerk wordt geactiveerd op de maximale niveaus in TG30Hi-GCTM-2Hi expressing cellen. Wij zijn van mening dat het gebruik van ons TG30/GCTM-2 FACS-protocol en het ophalen van P7 -TG30Hi-GCTM-2Hi) cellen grootschalige zuivering van verrijkte levende hESC-culturen mogelijk zou kunnen maken, als input voor differentiatietesten.
Concluderend tonen we hier de potentie van onze FACS-assays aan op basis van de gecombineerde expressie van oppervlakteantigenen TG30 en GCTM-2 voor zowel het zuiveren als verrijken van hESC’s. Toekomstige studies met protocollen voor gerichte differentiatie van hPSC’s zullen waarschijnlijk ook informatief zijn over deze potentialiteit. We zijn ons ervan bewust dat in sommige assays waarbij gedifferentieerde hESC-derivaten tijdelijk TG30 (CD9) of GCTM-2 uitdrukken, deze twee antilichamen mogelijk niet geschikt of voldoende zijn om pluripotente cellen op een bepaald moment in de test6uit een gedifferentieerde populatie te zuiveren . Daarom is er een voortdurende behoefte om nieuwe antilichamen te vinden die specifiek levende hESC’s herkennen om de mogelijke beperking van kruisreactie met sommige gedifferentieerde celtypen te overwinnen.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de StemCore-faciliteit van Monash University voor het leveren van hESC-lijnen en de FlowCore-faciliteit aan Monash University voor FACS-services. Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen van het Australian Stem Cell Centre, het New South Wales en victorian Government Stem Cell Research Grant Program to ALL. ALL is partneronderzoeker van het Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative in Stem Cell Science, Stem Cells Australia.
Materials
| Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| [header] | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. |
参考文献
- Pera, M. F., Tam, P. P. Extrinsic regulation of pluripotent stem cells. Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Polanco, J. C., Laslett, A. L., Lenka, N. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. Pluripotent Stem Cells. , (2013).
- Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 7, 12 (2007).
- Kolle, G., Ho, M., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7 (2010).
- Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).
- Schriebl, K., Satianegara, G., et al. Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody. Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).
- Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Michalska, A. E. Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3 (2007).
- Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells. PLoS One. 4, e7708 (2009).
- Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).
- Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O’Brien, C., Laslett, A. L. Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency. Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).
- Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. Nonclinical safety strategies for stem cell therapies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).
