Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

O vírus da doença de Newcastle (VDN), um paramyxovirus aviária pertencente ao gênero Avulavirus ^1, é um agente zoonótico economicamente relevante e, portanto, amplamente pesquisados ​​e vigiado, o que pode afetar gravemente a avicultura em todo o mundo. Embora não seja um patógeno humano, NDV também tem sido minuciosamente estudados para além do campo veterinário tanto como um modelo paramyxovirus e, devido às suas propriedades muito interessantes, oncolíticos naturais ^6. Pesquisa sobre NDV beneficiaram com o desenvolvimento de técnicas de genética reversa para, não-segmentadas vírus de RNA de sentido negativo de fita simples, primeiro descrito para o vírus da raiva por Conzelmann e coleagues ^2. Uma variedade de NDVs geneticamente modificados, portadores de genes ou modificações de seu tipo selvagem genoma estrangeiros têm sido amplamente estudado desde então. Trabalhar com estes vírus recombinantes tem sido fundamental para caracterizar diferentes fatores de virulência, não só de NDV, mas também de outros huma relevanten patógenos, como vírus da gripe A ⁷ – ou o emergente Nipah vírus ^8. Além disso, um certo número de diferentes estudos têm explorado o uso destas técnicas para melhorar a actividade anti-tumoral inato de NDV ^6,9,10, na maior parte, aumentando as propriedades imunoestimulantes dos vírus. Outra área relevante da pesquisa sobre NDVs recombinantes tem sido a geração de vacinas candidatas contra outras doenças virais, como a gripe ^{5,11,12, 13} de HIV, sarampo ^14, SARS ^15, ou que causada pelo vírus sincytial respiratório (RSV) ^16. Entre as várias vantagens notáveis ​​fornecidas por NDV são a ausência de imunidade preexistente em populações humanas, a estabilidade das inserções estrangeiras genéticas, falta de actividade recombinatórios e um perfil de segurança global elevada combinada com as acima mencionadas propriedades imunoestimulantes naturais ^17. Também é digno de nota o uso potencial de vacinas bivalentes recombinantes em poultry, a gripe aviária de proteção tanto contra NDV e altamente patogênico vírus ^11,12. Esta pode ser uma excelente maneira de diminuir as chances de o último espalhamento de selvagem a animais domesticados, contribuindo assim para evitar um possível salto inter-específica da gripe aviária temida para os seres humanos. Finalmente, o NDV-expressando repórter têm sido utilizados para a avaliação de respostas imunitárias inatas, bem como a identificação de antagonistas de interferão codificado por vários vírus ^18-27.

O processo de salvamento de uma forma recombinante, não segmentado, vírus de RNA de cadeia negativa consiste basicamente em forçar artificialmente um ciclo de replicação viral de uma célula produtora por transfecção de ADNc que codificam a maquinaria molecular infecciosa mínima, conhecido como ribonucleoproteína ou RNP (Figura 2). Os RNPs consistem em a polimerase viral (P e proteínas G), a nucleoproteína (NP) e o comprimento total de ARN antigenómico de vírus. Este RNA + antigenoma é thMolde e necessária para a geração dos genomas de ARN-complementares, as quais, também associados com o resto das proteínas da RNP virai, recapitula o mesmo complexo que um vírus infeccioso natural seria libertar no citoplasma da célula após a infecção (Figura 2A ). A partir deste passo em diante, o ciclo viral pode continuar naturalmente e os viriões recombinantes, encapsidar os genomas modificados, irá ser gerado (Figura 2B). Notavelmente, a transfecção de ADNc genómico, em vez do ADNc antigenï prejudica grandemente ou elimina completamente a eficiência de recuperação ^2,28-30. Mesmo quando cDNA antigenï é transfectada, a eficiência da encapsidação do ARN recombinante em RNPs em células transfectadas é provavelmente muito baixo. Devido a isso, os protocolos de salvamento para NDV geralmente incluem diferentes passos para a amplificação das poucas partículas virais libertadas das células originalmente transf por coculturing los com células permissivas e / ou pelainfecção de ovos embrionados.

Antes da recuperação, o cDNA pode ser manipulado por procedimentos de clonagem convencionais, de modo a gerar as modificações desejadas. Embora as mutações específicas dos diferentes produtos de genes e sequências reguladoras dos vírus pode ser directamente obtida desta maneira, muitos dos trabalhos publicados envolvendo NDV recombinante foi necessária a adição de uma nova unidade de transcrição no genoma de NDV. Como outros membros da família dos paramixovírus, o genoma de NDV codifica oito proteínas diferentes em seis unidades de transcrição, que são diferencialmente expressos em função da sua localização relativamente à extremidade 3 'de um gradiente decrescente crítico para o ciclo de vida do vírus ^1. Devido a isso, o local da nova unidade de transcrição dentro do genoma deve ser cuidadosamente escolhida para alcançar um equilíbrio entre a expressão do transgene e insuficiência de replicação viral. Inserção entre os genes P e M tem sido o mais usado, toutros sites Hough também foram testados ^13,31.

Seja qual for a inserção, a clonagem de cDNA para o NDV tem de seguir algumas regras para gerar um constructo rescuable: (i) qualquer novo gene a ser incluída dentro do genoma de NDV tem de estar sob o controlo dos sinais adequados para o vírus de ARN dependente de ARN- polimerase. Estas sequências devem ser adicionado a montante da nova estrutura de leitura aberta (ORF), de modo a polimerase pode reconhecer o fim do gene anterior (GE) e o início da nova transgene (GS), espaçadas por uma única sequência de nucleótidos intergénica (IG) . A adição de uma Kozak válido (K) de sequência para melhorar a tradução ribossomal eucariótica, também é recomendado para uma melhor expressão da proteína externa ^{de 32,} (ii) uma replicação eficiente de NDV, assim como para a maioria dos membros da família Paramyxoviridae, é dependente do comprimento do genoma sendo múltiplo de seis ^{de 33} e, portanto, qualquer inserção na NDV tem que seguir essa "regra de seis". Se necessário, reqnucleotídeos adicionais uired podem ser adicionados a jusante da nova ORF, e (iii) a seqüência do transgene devem ser verificadas para encontrar possíveis GE e GS como sequências que possam prejudicar a eficiência de recuperação, a expressão do transgene e / ou viabilidade vírus. Se presente, estas sequências devem ser removidas por mutagénese silenciosa. A geração de cDNA de comprimento total recombinante a seguir regras acima referidas é o primeiro passo para produzir eficientemente um NDV geneticamente modificado tal como descrito aqui.

No sistema de todas as construções de ADN está sob o controlo do promotor da polimerase de ARN de T7 (Figura 3). Esta polimerase citoplasmática é fornecido em trans pela co-infecção com um recombinante de vaccinia modificado Ankara vírus (MVA-T7) ^34. Figura 3A mostra o plasmídeo pNDV-B1, que codifica o ADNc de comprimento completo antigenï ^5. Figura 3B mostra os plasmídeos pTM1 codificando NP, P e L ORF. Os plasmídeos pCite-GFP, que codifica, under o promotor T7, a proteína verde fluorescente (GFP), e pCAGGS GFP ^18, que codifica para o mesmo ORF sob o promotor de beta actina de frango ^35, são utilizados como controlos. Neste protocolo, mostram o procedimento para resgatar NDV recombinante a partir do ADNc do NDV lentogénico estirpe Hitchner B1 ⁵ (Figura 4).