Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Dinamik bir etkileşim ve ikamet ettikleri bakteri ve bilgisayarlar arasında işbirliği evrim vardır. Bakteriler bağlılık organellere, salgı sistemleri ve / veya konak fagositik ve fagositik olmayan hücrelerin kendi üretken enfeksiyon etkinleştirmek toksin üretme yeteneği gelişmiştir. Bakteriler de tanıma ve konakçı bağışıklık sisteminin antimikrobiyal aktiviteleri ile uğraşmak gerekir. Ev sahibi, bağışıklık sistemi, fiziksel ve kimyasal engeller, bağışıklık hücreleri, tamamlayıcı sistemin, ve humoral bağışıklık diğer bileşenleri de dahil olmak üzere doğal ve adaptif bileşenden oluşur. Birçok bakteri tabakalı konak immün tepkisi ile öldürülmesi ve temizlik duyarlı olsa da, bazı patojenik ve fırsatçı bakterilerin konakçı hücrelerin çeşitli enfekte ve konak immün cevabı ¹ ile açıklık bozmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Neisseria gonorrhoeae bakteriyel patojen bir örneğidir Bu son derece insan konak. Yok inat uyarlanmıştır. gonorrhoeae kolayca ürogenital sistem, yutak, konjonktiva ve rektum mukoza epitelyal hücrelerin luminal yüzeyleri kolonize. Kolonizasyon mukozal sitelerde nötrofillerin bol işe tetikler. Nötrofiller mikroorganizmaları öldürmek için antimikrobiyal süreçlerin çeşitli sahip profesyonel fagositlerdir, ancak, N. gonorrhoeae nötrofillerin ^2-5 mevcudiyetinde hayatta kalma yeteneğine sahiptir. Böyle N. nasıl gibi bakteriyel patojenler Anlamak gonorrhoeae, yıkmak bastırmak ve sonuçta normalde düşman konak ortamlarda hayatta kalmak için bağışıklık tepkisini kaçırmak bulaşıcı hastalıklarla mücadele için yeni tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Genellikle konakçı hücreler bakteriyel hayatta araştırmak için kullanılan deneysel protokol koloni sayısı deneyleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı deneylerinde, enfekte olmuş hücrelerin bir popülasyonu wh bir deterjan ile, örneğin, (parçalananaich bakteriler bakteri serbest bırakmak için) dirençlidir. Lizatlar seyreltildi ve agar bazlı ortam üzerine plakalanmıştır ve lizatlardaki koloni oluşturucu birim, her bir zaman noktasında ve / veya deney koşulu için numaralandırılır edilir. Bu yaklaşım, tüm bakteri nüfusunun canlılığı bildirir ancak hücre içi ve hücre dışı yaşam arasında ayırım yeteneğine sahip değildir. Koloni sayımı tahlili, gentamisin koruma deneyinde, bir varyasyonu özellikle ökaryotik plazma zarı ⁶ geçmeye antibiyotik gentamisin yetersizlik dayalı hücre içi bakteri hayatta, ölçer. Bununla birlikte, bu deney, gentamisin (ya da benzer bir ökaryotik membran geçirgen olmayan başka bir antibiyotik) ile iç bakterilere erişmek için antibiyotiğin yetersizlik ile öldürmeye karşı hassas olan bakteri bağlıdır. Bu nedenle, bir gentamisin koruma deneyi, tüm bakteri türlerinin incelenmesi için etkili ya da başka yüksek bakteriyel hayatta incelerkennötrofiller gibi pinocytic hücreleri. (Bakteri agrega ya da farklı bireysel bakteriyel hücrelerden davranır mikrokoloniler formu ise gibi) bu yaklaşımların hiçbiri hücre içi lokalizasyonu ya da ayrı ayrı bakterilerin diğer davranışları ortaya koymaktadır. Tek tek dış ve iç bakteri canlılığı incelemek için sıkça kullanılan bir başka yaklaşım, ince kesitli transmisyon elektron mikroskobu (TEM) 'dir. Bu yaklaşım daha fazla hücre içi işaretleri karşı altın bağlanmış antikorları ile immunoelectron mikroskobu ile incelenmiştir edilebilir konakçı hücrelerde bakterilerin yere (örneğin, fagosom, sitoplazma, autophagosome), ilgili bilgi sağlayabilir avantajlıdır. Bununla beraber, elektron mikroskobu bakteri uygunluğu değerlendirmek özellikle duyarlı değildir. Gömülü bölümler uranil asetat, kurşun sitrat veya diğer elektron yoğun reaktifleri ile boyanmış ve elektron mikroskopi ile görüntülenmiştir zaman, elektron-yoğun bakteri uygun ve elektrik olarak kabul edilirtron-Lucent cansız ^7,8. Ancak, bu varsayım ciddi biçimde kesintiye membranların ve sitoplazma yoksun olan sadece bu ölü bakteri beri elektron-Lucent görünür, bakteri canlılığı overestimates. Ayrıca, bazı bakteri türlerinin zor canlılığını belirlemek için yapım büyüme aşamasına bağlı olarak, kendi elektron yoğunluklarının bir aralığını görüntüleyebilir.

Alternatif bir ya da bu yaygın olarak kullanılan yöntemlere ilave olarak olduğu gibi, burada eklenmiş ve konak hücreleri ile içeride bakterilerin hayatta kalmasını değerlendirmek için bakteriyel canlılığı göstermektedir floresan boyaların kullanımı için protokoller ve mantığını sağlar. Hücre dışı bakteriler belirlemek için, enfekte olmuş hücreler, ilk olarak bir lektin ya da bakteri özgü antikor gibi bir flüoresan tepkime maddesi, maruz kalmaktadır. Enfekte edilen hücreler daha sonra geçirgen ve bakteriyel canlılığı için bir vekil olarak, bozulmuş membran vs bozulmamış bakterilere farklı olarak erişilebilir DNA özgü boyalar maruz kalmaktadır. İlk olarak ppropidium iyodür membranlar tehlikeye ve böylece cansız kabul edilen bu bakterilerin sadece erişilebilir ise otokol, membran geçirgen boya SYTO9, toplam bakteri nüfusu tanımlar. Propidium iyodür ve SYTO9, Biyofilmlererde bakteri canlılığı değerlendirmek patojenik bakterilerin patojenik ayrımcılık ve uygulanabilir su-kaynaklı bakteri ^9-12 numaralandırmak için kullanılır olmuştur. SYTOX Green cansız nüfusa erişilebilir iken, ikinci protokolde, 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), toplam bakteri tanımlar. Bu canlılığı boya çifti bakteriyel hücre içi lokalizasyonu tanımlamak Örneğin, ilgi konusu bir protein ile ilgili olarak her bir bakterinin yerini belirlemek için bağışıklık ile kombine edilebilir. Bu tahlillerin kullanılması konak hücrelerin enfeksiyonu esnasında bakteri öldürme veya hayatta kalması ile sonuçlanabilir etkileşimler içine önemli bilgiler sağlar. Bu makalede anlatılan protokoller canlılığı ve değerlendirmek için kullanılmıştırNötrofil phagosomes ^5,13,14 farklı toplumlarda da dahil olmak üzere temel insan nötrofil, ve içine bağlanmış olup, N. gonorrhoeae. Bununla birlikte, bu protokoller profesyonel fagositlerin, non-profesyonel fagositlerin ve protozoa ^15-24 gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerin uygulanabilirliğini değerlendirmek için uygulanabilir.