A função dos neurônios de mamíferos nascido de adultos continua a ser uma área ativa de pesquisa. A radiação ionizante inibe o nascimento de novos neurônios. Usando computador guiada por tomografia irradiação focal (CFIR), segmentação anatômica tridimensional de populações específicas progenitoras neurais agora pode ser usado para avaliar o papel funcional da neurogênese adulta.
A caracterização funcional de neurônios nascido de adultos continua a ser um desafio significativo. Abordagens para inibir adulto neurogenesis via entrega viral invasiva ou animais transgénicos têm potenciais confunde que tornam a interpretação dos resultados a partir destes estudos difícil. Novas ferramentas radiológicos estão surgindo, no entanto, que permitem que se investigue de forma não invasiva a função de selecionar grupos de neurônios nascido de adultos por meio da segmentação anatômica exato e preciso em pequenos animais. Radiação ionizante Focal inibe o nascimento e diferenciação de novos neurônios e permite a segmentação de regiões específicas progenitoras neurais. A fim de esclarecer o papel funcional potencial que a neurogênese adulta hipotálamo desempenha na regulação de processos fisiológicos, desenvolvemos uma técnica de irradiação focal não-invasivo para inibir seletivamente o nascimento de neurônios nascido de adultos na eminência mediana do hipotálamo. Nós descrevemos um método para C omputer guiada por tomografiaf ocal ir radiação (CFIR) entrega para permitir anatômico preciso e exato visando em pequenos animais. CFIR usa orientação imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose de radiação, minimiza a exposição à radiação de regiões cerebrais nontargeted, e permite a distribuição da dose conformada com fronteiras nítidas feixe. Este protocolo permite fazer perguntas sobre a função dos neurônios nascido de adultos, mas também abre as áreas de perguntas em áreas de radiobiologia, biologia do tumor, e imunologia. Estas ferramentas radiológicos irá facilitar a tradução de descobertas no banco à cabeceira.
Descobertas recentes demonstraram que o cérebro de mamíferos adultos pode ser submetido a um notável grau de plasticidade. Neurônios-nascido adultas são gerados durante a vida adulta em nichos especializados do cérebro dos mamíferos 1. Qual é a função desses neurônios nascido de adultos? E mais ainda, que eles desempenham um papel na fisiologia e comportamento? Estudos sobre o tema têm, tradicionalmente focada na zona subventricular dos ventrículos laterais ea zona subgranular do hipocampo, no entanto, estudos recentes têm caracterizado a neurogênese em outras regiões do cérebro, como o hipotálamo dos mamíferos 2. Neurogenesis foi avaliado no pós-natal e adulto hipotálamo 2-10, e a função destes neurónios hipotalâmicos-nascidos ainda uma área activa de investigação.
A caracterização funcional de neurônios nascido de adultos continua a ser um desafio significativo para o campo da neurociência em geral. Inibição seletiva de especificaçãoIFIC populações progenitoras neurais permanece limitada pela falta de marcadores moleculares disponíveis, que são únicas para populações progenitoras neurais individuais 11. Assim, a eliminação seletiva dos neurônios nascido de adultos destes progenitores neurais através de segmentação genética continua difícil. Da mesma forma, a entrega viral para atingir os neurônios nascido de adultos sofre de potenciais variáveis de confusão, tais como a introdução de lesão e inflamação no ambiente 12.
Novas ferramentas radiológicos estão surgindo, no entanto, que permitem contornar essas confunde e investigar essas questões por meio da segmentação anatômica exato e preciso em pequenos animais. A radiação ionizante inibe o nascimento e diferenciação de novos neurônios, e permite que um método não invasivo para atingir populações progenitoras neurais 13-15. Recentemente, descrevemos uma região germinal da eminência mediana do hipotálamo dos mamíferos (ME) que denominou a zona proliferativa hipotálamo (ZAP) 2 </sup>. Descobrimos que quando ratos jovens adultos do sexo feminino receberam uma dieta rica em gordura (DFH), os níveis de neurogênese em ratos HFD-alimentados foram substancialmente mais elevadas do que a sua comida normal (NC) controles alimentados nesta região ME 2. Para testar se a neurogênese adulta dentro do ME hipotálamo regula o metabolismo e do peso, buscou-se interromper esse processo. A eminência mediana é uma pequena estrutura unilateral na base do terceiro ventrículo a partir do qual as hormonas reguladoras são libertados. A fim de inibir a proliferação e neurogênese posterior sem alterar as outras funções fisiológicas desta região do cérebro, desenvolvemos uma técnica de irradiação focal não-invasivo para inibir seletivamente o nascimento de neurônios adultos recém-nascidos na eminência mediana do hipotálamo 2.
Vários grupos têm utilizado a radiação para suprimir a neurogênese em regiões canônicas 14-28. No entanto, as abordagens radiológicos anteriores geralmente alvo de grandes áreas, ou often involuntariamente também alvejado várias áreas do cérebro onde foi reportado a neurogênese, o que torna difícil para associar de forma inequívoca quaisquer defeitos comportamentais observadas com defeitos em populações específicas progenitoras neurais. A capacidade de irradiação mais direcionado é fornecido pelo plataformas radiológicos que combinam c omputer imagem guiada por tomografia com f ocal ir feixe de radiação (CFIR) entrega para permitir anatômica mira de precisão 29-36. Feixes de radiação tão pequenas quanto 0,5 mm de diâmetro estão disponíveis para atingir populações progenitoras neurais específicos 35. Esta metodologia permite-nos atingir o ME hipotálamo e prender proliferação e bloqueiam a neurogênese em pequenos animais. Após o tratamento radiológico nestas populações progenitoras, testes fisiológicos e comportamentais podem ser realizados para esclarecer a função potencial de células-nascido adultos. Segmentação focal é especialmente importante para a nossa aplicação, desde oglândula pituitária está localizado perto da eminência mediana do hipotálamo; irradiação da hipófise pode afetar a função hormonal e, posteriormente, confundir os resultados.
A base biológica para a supressão da neurogênese após irradiação ainda permanece obscuro. Estudos de radiação anteriores têm contado com grandes vigas área, e concluíram que a supressão da neurogênese é mediada através de uma resposta inflamatória 14, 37. Como tal, não está claro se a irradiação altamente focal poderia suprimir a neurogênese, uma vez que não evocar uma resposta inflamatória substancial. No entanto, estudos recentes do nosso grupo do clássico região neurogénica no hipocampo têm demonstrado que a irradiação altamente focal com uma dose de 10 Gy, pode suprimir a neurogénese durante pelo menos 4 semanas após a irradiação 35.
Para interrogar a função dos neurônios do hipotálamo nascido de adultos na eminência mediana, usamos uma radiação precisão device capaz de fornecer imagens CT em combinação com feixes de radiação de pequeno diâmetro para inibir a neurogênese ME. Utilizando um tubo de raio-X acoplado a um pórtico que gira ao longo de um intervalo de 360 °, que entregam arco de feixe do feixe de micro irradiação com o uso de uma fase de amostra controlado roboticamente, que permite a rotação de um sujeito animal durante o tratamento de radiação (Figura 1) . Uma maior resolução do detector de raios-X é utilizado para a aquisição de imagens, quando o pórtico está na posição horizontal 33. Para este estudo, imagens de TC foram reconstruídos com um tamanho de voxel isotrópico de 0,20 mm. No bordo de imagem CT permitiu a identificação de um alvo, enquanto o animal está na posição de tratamento. O alvo foi localizado usando o software de planejamento de dose de navegação CT, que foi incluído com a nossa plataforma radiológicos disponíveis comercialmente. Depois de localizar o nosso ROI por imagem CT, o animal foi movido para a posição de tratamento adequado pelo estágio espécime robótico que tem quatro grausRees de liberdade (X, Y, Z, θ). Através de uma combinação de ângulos de pórtico e estágio robô, vigas podem ser entregues a partir de quase qualquer direção em relação ao animal, e tratamentos de arco-like estereotáxica são possíveis 29. Para estes e todos os outros estudos de imagiologia, os ratos foram colocados num dispositivo de imobilização, que permite a libertação de gás anestésico de isoflurano durante a restringir o movimento. A cama de imobilização é CT compatível, e se conecta ao palco espécime robótico 34.
Esperamos que CFIR proporcionará avanços conceituais em um número de áreas de investigação. Apesar de usarmos segmentação radiológica da eminência mediana do hipotálamo como prova de princípio desta técnica, CFIR pode ser usado para atingir qualquer região do corpo de qualquer modelo pequeno organismo em princípio. Nos ciências neurológicas, por exemplo, prever que esta técnica pode ser utilizada para avaliar a função de populações progenitoras activamente proliferativas que têm sido sugeridos para exist em outros órgãos circumventricular, tais como a área postrema 38, 39, 40 do órgão subfornical e na hipófise 41. Controvérsias de longa data sobre o papel funcional da neurogênese adulta e identificação de um papel causal no comportamento também pode agora ser melhor abordados. Em aves canoras, esta técnica pode abordar o papel da neurogênese adulta na manutenção do comportamento robusto e sazonal do canto dos pássaros 42, que tem sido dificultado pela capacidade de inibir seletivamente a neurogênese em regiões específicas do cérebro. Compreender este modelo comportamental robusto pode lançar uma nova visão sobre o papel da neurogênese adulta na regulação de outros comportamentos sexualmente dimórficos. Em alternativa, no campo metabólica, CFIR pode ser usada para explorar aspectos do papel de proliferação dos hepatócitos e o seu papel no metabolismo e no balanço de energia. A possibilidade de avanço conceptual em várias disciplinas de investigação é aumentada pela introdução desta técnica.
<p class= "Jove_content"> Neste artigo, vamos demonstrar as capacidades do CFIR para anatômica precisão direcionamento de um feixe de irradiação focal. Embora inicialmente desenvolvido esta plataforma de pesquisa de radiação de pequenos animais (SARRP) para os nossos estudos, outros dispositivos similares já estão comercialmente disponíveis que podem realizar irradiação semelhante guiada por TC focal 43, 44. Por isso, nós generalizamos este protocolo CFIR com passos necessários para todas as plataformas de pesquisa, em vez de os específicos para SARRP. As vantagens das abordagens mais CFIR radiológicos anteriores para inibir a neurogénese são que esta técnica permite a orientação da imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose, a dose conformada minimiza a exposição de regiões cerebrais nontargeted, e geometria do feixe de alta precisão permite a distribuição da dose com conformado limites feixe afiadas. Nós delineamos como usar imagens CT-guiada para atingir a dose a uma região anatômica específica, e ao fazê-lo, como visualizar a radiaçãodose de distribuição diretamente no tecido usando coloração imuno-histoquímica para γ-H2AX, um marcador de DNA quebras de fita dupla 35, 45-48. A utilização desta abordagem para a irradiação seletiva de nichos neurogênicos podem ter implicações significativas na revelando o papel funcional de novos neurônios nascido de adultos sobre a fisiologia e doenças.Irradiação focal CT-guiada (CFIR) é uma abordagem nova e completa do sistema capaz de fornecer campos de radiação a alvos em pequenos animais sob controle robótico usando CT-orientação 32. A capacidade de CFIR para entregar vigas altamente concentrado para pequenos modelos animais proporciona novas oportunidades de pesquisa para colmatar pesquisas de laboratório e tradução clínica. Este artigo descreve a abordagem CFIR para entrega radiação preciso para atingir especificamente uma população pr…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos C. Montojo, J. Reyes, e M. Armour para aconselhamento e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por Institutos Nacionais de Saúde dos EUA concessão F31 NS063550 (para DAL), um prêmio Basil O'Connor Iniciado Scholar e subvenções do Fundo Klingenstein e NARSAD (a SB). SB é um WM Keck Distinguished Scholar Jovem em Pesquisa Médica.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
SARRP research platform | Xstrahl | RS225A | http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm |
SARRP irradiation bunker | Xstrahl | Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding | |
GAF chromic film | IPS | GAFchromic ETB2 | |
Mouse phantom | Gammex | 457 | Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size. |
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody | Millipore, Inc. | 05-636 | clone JBW301 |
High-fat rodent diet | Research Diets | D12492i | 60% of the calories as fat, food should be irradiated |
Isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | 10019-360-40 | |
0.01 M Sodium citrate | Fisher Scientific | 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
DAPI | Fisher Scientific | nuclear counterstain | |
Mounting medium | Fisher Scientific | Vectashield or Gelvatol is preferred |