A electroporação é um método vulgarmente utilizado para a introdução de ADN em bactérias, num processo conhecido como transformação. Protocolos tradicionais para a preparação de células electrocompetentes são demorados e trabalhosos. Este artigo descreve uma alternativa, rápida e eficiente método para a preparação de células electrocompetentes atualmente empregadas por alguns laboratórios.
A electroporação tornou-se um método amplamente utilizado para rapidamente e eficientemente a introdução de ADN estranho em uma ampla variedade de células. Eletrotransformação tornou-se o método de eleição para a introdução de ADN em procariotas que não são naturalmente competente. A electroporação é um método de transformação rápida, eficiente, e simplificada, que, além de ADN purificado e bactérias competentes, requer disponível comercialmente controlador de impulsos de genes e tinas. Em contraste com o passo de condicionamento, a preparação de células electrocompetentes é moroso e de trabalho intenso que envolve ciclos repetidos de centrifugação e lavagens com uma redução dos volumes de água esterilizada, fria, ou tampões não-iónicos de grandes volumes de culturas cultivadas até à fase semi-logarítmica crescimento. Tempo e esforço podem ser salvas através da compra de células electrocompetentes de fontes comerciais, mas a seleção é limitada a comumente empregada E. estirpes laboratoriais coli. Estamos aqui divulgando uma rápida emétodo eficiente para preparar electrocompetentes E. coli, o que tem sido utilizado por laboratórios de bacteriologia por algum tempo, pode ser adaptado para V. cholerae e outros procariotas. Embora não possamos saber quem ao crédito para o desenvolvimento da técnica original, estamos aqui tornando-o disponível para a comunidade científica.
Desde a sua 'criação no início dos anos 1980 1, eletroporação tornou-se uma técnica de biologia molecular integral, provavelmente, o único método mais comum empregado para transformar / transfectar células vivas com ácidos nucléicos circulares ou lineares. Desenvolvida originalmente para a transfecção de células eucarióticas 1, electroporação foi subsequentemente adaptado para a transformação de E. coli 2, 3. Em bacteriologia, electroporação tornou-se o padrão de laboratório e foi modificado para transformar uma vasta gama de bactérias, incluindo bactérias Gram-negativas Pseudomonas 4, 5 Salmonella, Vibrios 6, Serratiae, e bacilos disentéricos 7; Clostridia Gram-positivos 8, Bacilos 9, 10 Lactobacilos e enterococos 11. Mesmo algumas arqueobactérias provaram susceptível à transformação por electroporação, incluindo Methanococci </em> 12 e 13 Sulfolobus espécies. Para uma revisão abrangente consulte Aune e Aachmann 14. Eficiência de transformação por eletroporação é declaradamente 10-20 vezes maior do que a competência química ou choque térmico 2. No entanto, assim como a preparação de bactérias para a competência química como otimizado por Douglas Hanahan na década de 1980 15, as células também deve estar preparado para ser electrocompetentes.
Eletroporação é um meio rápido e eficaz de transformação bacteriana, exigindo bactérias electrocompetentes, DNA purificado, um módulo de controle de pulso que fornece o impulso elétrico, e uma câmara que acomoda pequenas células descartáveis, que funcionam como um eletrodo. Resumidamente, as bactérias competentes frias, são misturados com o DNA de plasmídeo, submetido a um impulso de alta tensão numa cuvete, ressuspensas em meio de crescimento, incubadas a 30-37 ° C durante 30-45 min, e, em seguida plaqueadas em meio semi-sólido (agar nutriente placas), com a aproxopriate antibiótico seletiva.
Em contraste com o passo de condicionamento, a preparação de electrocompetentes E. coli continua a ser um processo de várias partes que tradicionalmente é realizado em grandes volumes. Resumidamente, uma cultura durante a noite de bactérias é inoculado num balão de Erlenmeyer com 100 ml a 1 litro de Luria Broth (LB), crescidas até à fase semi-logarítmica de crescimento (DO600 de <1,0), e sujeitos a lavagens em série com um não estéril iónico tampão ou água bidestilada (ddH2O), em uma redução dos volumes a 4 ° C. Grande cuidado deve ser tomado para manter as células frio durante todo o procedimento e evitar a contaminação. Isto requer a utilização de baldes centrifugação autoclavados e tampões não-iónicos ou ddH2O, uma incubadora agitador orbital, um volume grande de alta velocidade centrífuga refrigerada e um conjunto de rotores. As bactérias são finalmente ressuspensas num pequeno volume de tampão suplementado com 10% de glicerol e divididas em alíquotas para ~ 40 volumes ul, which são armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. De armazenamento a baixa temperatura, muitas vezes resulta em eficiências de transformação diminuiu, devido à perda de viabilidade ao longo do tempo.
Células bacterianas electrocompetentes estão também disponíveis a partir de uma variedade de fontes comerciais, mas apenas para um número limitado de (frequentemente recombinação deficiente) E. coli como hospedeiros vulgarmente utilizados para propagar uma vasta gama de plasmídeos. Como resultado os pesquisadores contam com métodos in-house para preparar as suas próprias linhagens / mutantes para a transformação.
Um suplente, protocolo rápido e eficiente para a preparação de electrocompetentes E. coli tem sido usada por alguns laboratórios de bacteriologia molecular por algum tempo e agora foi estendido para as bactérias Gram-negativas adicionais, no nosso caso V. cholerae. O criador do protocolo não pode ser identificado, pois foi otimizado por outros pesquisadores ao longo do tempo. O método aqui apresentado foi usado no nosso laborats por quase duas décadas, e é nosso objetivo de compartilhar esse protocolo útil com nossos pares.
A eficiência de transformação é sujeito a uma variedade de fatores, independentemente do método utilizado para preparar as células competentes. Variáveis análogas são aplicáveis a este método, um grande cuidado deve ser tomado para que uma vez que as células são colhidas a partir da placa de agar tal que eles são mantidos a baixa temperatura constante (não superior a 4 ° C). A camada de bactérias deve ser activamente crescente no momento da recolha, as células devem estar em fase semi-logarítmica de crescimento. Qualidade do ADN (isto é, a contaminação de sais) influencia a eficiência de transformação. Especificamente, quando se emprega este método, o ágar não deve ser quebrado como fragmentos de agar na cuvete irá causar faíscas do pulso.
A maioria dos problemas encontrados com esta técnica está associada com dois problemas, recolhendo as bactérias durante a janela de tempo apropriada da placa de agar, quando eles estão em crescimento activo. Coletá-los muito em breve trará o número de células insuficientes e irá processar araspando a placa de agar LB frustrante porque o "pellicule" formam é difícil de levantar para fora da superfície da placa. Bactérias Coleta tarde vai diminuir drasticamente a sua competência. A janela de tempo irá variar, naturalmente, dependendo da densidade de inoculo semeado em placas de agar LB. O segundo passo essencial é a de manter as bactérias frio (4 ° C) a partir do momento em que eles são levantados para fora da placa de ágar e ressuspensas em CaCl 2 ou ddH2O até serem semeadas em agar LB transformação seguinte. Os tubos de microcentrífuga contendo as bactérias, cuvetes e tampão deve ser pré-arrefecido e mantido em gelo para todas as vezes até que as bactérias são plaqueadas. No entanto, problemas adicionais podem surgir quando a estéril ddH2O ou CaCl2 conter precipitado ou contaminados. Por este motivo, recomendamos a elaboração deste novo reagente.
Solução de problemas de transformação é facilitada pela inclusão de controles ao transformar bacteria prestados competente por qualquer método. Um controle negativo constituído por um grupo de bactérias competentes não transformadas semeadas em uma placa de ágar LB contendo o marcador selectivo irá ajudar rapidamente determinar se o antibiótico na placa é eficaz. A transformação do controlo positivo com uma preparação plasmídeo conhecido de boa qualidade e quantidade abrigar o mesmo marcador seletivo como a amostra experimental será útil para determinar se as bactérias são competentes, mas também se o DNA experimental transformada foi suficiente em quantidade ou qualidade.
As vantagens desta técnica são múltiplos, o método pode ser realizado no mesmo dia em que a transformação é planejado. Nós descobrimos que o estoque de glicerol bacteriana congelado pode ser banhado diretamente sobre o agar LB sem qualquer perda na electrocompetence, temos feito isso em situações de "emergência" (depois de esquecer de iniciar a cultura durante a noite do dia anterior). Embora não pudemos testar emuito estirpe conhecida, qualquer E. coli ou V. cholerae tensão que pode ser transformado por eletroporação tem sido favorável a este protocolo em nossas mãos. A técnica é rápida, eficaz e produz eficiências de transformação comparáveis aos obtidos desde a preparação bactérias electrocompetentes empregam métodos tradicionais. O método elimina a necessidade de centrífuga de alta velocidade e de rotores associados, num agitador orbital incubadora e baldes de centrífuga estéreis (recipientes), e grandes volumes de tampão autoclavado. Embora a tabela de reagentes específicos e Equipamentos é bastante abrangente, a maioria dos laboratórios que realizam eletroporação terá a maioria, se não todos, estes materiais já disponíveis. Talvez o mais importante, a técnica pode ser facilmente aplicado para gerar estirpes electrocompetentes específicos do laboratório com fundos mutantes rapidamente. Não temos conhecimento de quaisquer limitações desta técnica, uma vez que substituiu o método tradicional de preparação de electrocompetent bactérias nos nossos laboratórios.
Os resultados de nossas experiências mostradas aqui foram realizados com células electrocompetentes frescos produzidos com o método tradicional, que tinha sido armazenado a -80 ° C durante não mais de 1 semana. No entanto, os estoques de células congeladas electrocompetentes de perder competência e viabilidade ou durante longos períodos de armazenamento. O protocolo simplificado permite a preparação de células electrocompetentes fresco no mesmo dia da transformação está prevista, sem preocupações com a idade do material, que podem resultar em rendimento transformante diminuiu. Não tentamos armazenar células electrocompetentes produzidos usando o método rápido para uso em outro dia, pois isso não foi necessário.
Embora não seja mostrado aqui, a eficiência das células electrocompetentes preparadas utilizando o nosso método rápido é suficiente para misturas de ligação. As transformações relatados para não-O1 V. cholerae em um recente artigo de Unterweger et al.17 foram realizados com bactérias electrocompetentes preparadas pelo método descrito aqui (exceto as realizadas por conjugação). Esta técnica permite aos pesquisadores transformar cepas mutantes com fundos rápida e eficazmente sem ter que preparar grandes quantidades de células. Este método de preparação rápida de bactérias electrocompetentes pode ser adaptado para outros procariotas que foram mostrados para ser passível de electroporação, como o princípio da preparação e as definições de eletroporação vão ser as mesmas que as de protocolos tradicionais.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem aos colegas e funcionários de laboratórios presentes e passadas que têm apoiado o desenvolvimento desta técnica. Laboratório de SP é apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde Grant operacional MOP-84473 e Alberta Soluções Inova-Saúde (financiados pela Fundação Alberta Heritage para Fundo de Doações de Pesquisa Médica). DP de foi apoiado pelo National Institutes of Health concede MD001091-01 e GM068855-02.
Name of the Equipment | Company | Catalogue number |
Gene Pulser Module | Bio-Rad | 165-2668 |
Gene Pulser Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2669 |
Electrocuvettes (0.2 cm gap) | Bio-Rad | 165-2082 |
13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes | Corning | 70820-13 |
13 mm Culture Tube Closures | Cole Parmer | EW-04500-00 |
6 x 250 mm Glass Rod | Lab Source | 11381D |
Disposable Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 |
Roller Drum Motor Assembly | New Brunswick Scientific | M1053-4004 |
Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes | New Brunswick Scientific | M1053-0306 |
Calcium chloride | Sigma Chemicals | C5670 |
Ethanol, anhydrous/denatured | Sigma Chemicals | 227649 |
Inoculating Loop | Decon Labs | MP182-5 |
Refrigerated Microcentrifuge 5451 R | Eppendorf | 22621425 |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 03-917Q |
LB Broth MILLER | EMD | 1.10285.0500 |
Bacteriological Agar | Fisher Scientific | S25127 |