Количественная оценка респираторный взрыв ответ как показатель врожденной иммунной здравоохранения в данио рерио

Иммунная система состоит из двух ветвей: врожденного и адаптивного иммунитета. Врожденный иммунитет является эволюционно более древняя, чем адаптивного иммунитета. Беспозвоночные в настоящее время полагают, только врожденный иммунитет, тогда как позвоночные обладают как врожденные и адаптивные ветви. В то время как адаптивный иммунитет дает конкретные и длительный иммунитет к определенным патогенов, врожденный иммунитет является непосредственным ответом на вторжение бактерий, вирусов и грибков. Одним из важнейших аспектов врожденного иммунного ответа связан с высвобождением цитокинов и хемокинов, что приводит к воспалению и найма фагоцитов (например макрофаги, нейтрофилы), чтобы поглотить и уничтожить иноземных захватчиков.

Успешные врожденные иммунные реакции включают: (1) признание вторжения микроорганизмов; (2) индукция соответствующих сигнальных каскадов (например высвобождение цитокинов и хемокинов); (3) надлежащее развитие / необходимого числа фагоцитов; (4) Миграция фагоцитов в местах инфекции; (5) охвате патогенов, и (6) уничтожение охвативших микроорганизмов. Дефицит в любом из этих шагов может привести к хосту быть раздавленными, а поддавшись, инфекции. Надежная врожденного иммунного ответа является жизненно важным для здоровья организмов, потому что это первая линия обороны против патогенов во всех растений и животных. У позвоночных, он также усиливает адаптивный иммунный ответ ^1. Поэтому очень важно, чтобы мы в состоянии оценить все аспекты врожденного иммунного ответа, с тем, чтобы лучше понять его и оптимизации его функции.

Многие модельные организмы используются для изучения врожденного иммунитета, начиная от Arabadopsis к С. Элеганс в дрозофилы до мышей к культуре клеток человека. Преимущество использования данио (Danio рерио) модель системы для изучения врожденного иммунитета является то, что данио является позвоночным, как с врожденного и адаптивного имсообщества, но развитие врожденного и адаптивного иммунитета временно отделены. Данио рерио полагаться исключительно на врожденного иммунитета для защиты от инфекций, пока адаптивный иммунитет не станет полностью функциональной, которое происходит вокруг 4-6 недель после оплодотворения ^2. Кроме инструментов для генетических манипуляций, оптической прозрачности и быстрого, внешнего развития, врожденный иммунитет как принцип режиме обороны у эмбрионов рыбок данио обеспечивает упрощенную модель, в которой для изучения сложности врожденного иммунного ответа в естественных условиях.

Несколько протоколы были разработаны для оценки различных аспектов врожденного иммунного ответа у эмбрионов рыбок данио. Microarrays и RNAseq быть подтверждено, что цитокин профили вызываемые данио врожденного иммунного ответа аналогичны у людей и также показали участие неожиданных генов в врожденного иммунитета ^3,4. Прозрачность эмбрионов рыбок данио и люминесцентные, трансгеннойштаммы ИЦ патогенов и рыбок данио позволяют для визуализации динамических взаимодействий хозяин-патоген в естественных условиях в режиме реального времени. Трансгенные эмбрионы рыбок данио, выражающие GFP под контролем нейтрофилов конкретных миелопероксидазы промоутер ^5,6 или макрофагов конкретных mpeg1 промоутер ⁷ сделали возможным визуализировать и количественно фагоцитов миграцию к местам локализованных инфекций ^8, а также визуализировать фагоцитоз и разрушение флуоресцентно меченных патогены ^8,9. Эмбрионы рыбок данио также поддаются генерации высокой пропускной анализов и химических экранов. Соответственно, недавно были разработаны методы высокой пропускной из транскриптома анализа при инфекции ¹⁰ и фагоцитов миграции к местам химически индуцированного повреждения ^11.

Из методов, перечисленных выше, ни один количественно не оценить заключительный этап уничтожения возбудителя фагоцитами. Это заключительный этапвключает в себя респираторный взрыв (то есть производства АФК и других токсичных соединений), убивающих охвативших патогенов. Фермент НАДФН оксидазы является основным источником АФК в фагоцитирующих клеток. Ассамблея субъединиц НАДФН энзима приводит к переносу электронов к кислороду, генерации супероксид-анионы. Через последующих ферментативных реакций, супероксид затем могут быть преобразованы в перекиси водорода и хлорноватистой кислоты (фигура 1А). Это респираторный взрыв фагоцитов, который убивает болезнетворные микроорганизмы и, таким образом, количественное определение респираторный взрыв потенциала эмбрионов данио рерио является показателем общей врожденной иммунной здоровья. Мы разработали флуоресценции основе анализа для количественной оценки респираторный взрыв в группах отдельных эмбрионов рыбок данио ^12. Этот анализ использует не-флуоресцентный, восстановленную форму коммерчески доступной, проникающий в клетку краситель. Этот краситель, 2 ',7-диацетат dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA), преобразуется в флуоресценциицент соединение, 2 ',7-дихлорфлуоресцеина (DCF), при окислении. Различные ROS, генерируемые дыхательного взрыва фагоцитов может окислять H2DCFDA и генерировать флуоресценции ^24. Появление флуоресценции могут быть использованы для количественного определения и сравнить ответ респираторный взрыв между группами данио. Протеинкиназы С ацетат агонист форбол-миристат (PMA) используется для химически индуцировать НАДФН-оксидазы, чтобы произвести ROS и тем самым увеличить показания флуоресценции (рис. 1b). При этом мы предоставляем подробный протокол модифицированной и оптимизированной версии этого данио эмбрионов респираторный взрыв анализа. Этот анализ может быть использован для сравнения респираторный взрыв между группами отдельных эмбрионов данио рерио с течением времени и / или в ответ на экспериментальных манипуляций (например, морфолино-опосредованного белком нокдаун). Использование этого метода, в сочетании с другими данио врожденных анализов иммунитета, обеспечит более полное представление о сложной и критическойврожденного иммунного ответа.