דור וQuantitation 3 ממדים של עורקי פצעים בעכברים באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית
概要
Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.
Abstract
הדור והניתוח של נגעים של כלי דם במודלים של בעלי החיים מתאימים הוא אבן יסוד של מחקר למחל לב וכלי דם, יצירת מידע חשוב על פתוגנזה של היווצרות נגע והפעולה של טיפולים חדשניים. שימוש בעכברי טרשת עורקים נוטים, שיטות ניתוחיות של אינדוקציה נגע, ושינוי תזונתי השתפרו באופן דרמטי את ההבנה של המנגנונים שתורמים להתפתחות מחלה ואת הפוטנציאל של טיפולים חדשים.
קלסי, ניתוח של נגעים מתבצע לשעבר vivo תוך שימוש בטכניקות היסטולוגית 2-ממדיות. מאמר זה מתאר יישום של טומוגרפיה אופטית הקרנה (השטחים הכבושים) לכימות 3 ממדים של נגעים בעורקים. כטכניקה זו היא שאינה הרסנית, הוא יכול לשמש כתוספת לניתוחים היסטולוגית וimmunohistochemical סטנדרטיים.
נגעי Neointimal היו נגרמים על ידי חוט-הכנסה או קשירה של אמנות הירך העכברery תוך נגעים טרשתיים נוצרו על ידי ממשל של דיאטת atherogenic לעכברי apoE הלקויים.
נגעים נבחנו באמצעות הדמיה השטחים הכבושים של פליטת autofluorescent אחרי היסטולוגית משלים וניתוח immunohistochemical. Opt נגעים להבחין בבירור מקיר כלי הדם הבסיסי. גודל נגע חושבו בסעיפים 2 ממדים באמצעות planimetry, המאפשר חישוב שטח חתך מקסימאלי נפח נגעים ו. נתונים שנוצרו באמצעות השטחים הכבושים היו בקנה אחד עם מדידות שהושגו באמצעות היסטולוגיה, המאשרים את הדיוק של הטכניקה ואת הפוטנציאל שלה כהשלמה (ולא חלופי) לשיטות מסורתיות של ניתוח.
עבודה זו מדגימה את הפוטנציאל של השטחים הפלסטיניים הכבושים הדמיה טרשת עורקים וneointimal. הוא מספק טכניקה מהירה, צורך הרבה vivo לשעבר לכימות 3 ממדים השגרתיים של שיפוץ כלי דם.
Introduction
היווצרות נגעים בעורקים היא מרכזית לתחלואה הגבוהה ותמותה הקשורים במחל לב 1. היווצרות נגע נחשבת ללהיגרם על ידי תגובה דלקתית בלתי מוגבלת לפגיעה עורקת 2. טרשת עורקים יוצרת לאט בתגובה לפציעה כרונית לדפנות העורקים ואילו נגעי restenotic לפתח במהירות הבאה נזק מכאני חריף (למשל, לאחר השתלת סטנט). המנגנונים שתורמים להתפתחות נגעים בעורקים כבר הבהירו באופן משמעותי על ידי השימוש במודלים של בעלי החיים מתאימים, לעתים קרובות בשילוב עם מניפולציות גנטיות רלוונטיות 1.
ניתוח של גודל נגע והרכבו קלסי תלוי במידה רבה על vivo לשעבר, היסטולוגיה 2 ממדים (אם כי זה משתנה עם התפתחות שיטות משופרות לin vivo ואיתור vivo לשעבר וניתוח של נגעים בבעלי חיים קטנים <sup> 3). ניתוח היסטולוגית של נגעים בעורקים הוא עבודה אינטנסיבית, זמן רב ומספק מידע מוגבל למבנה 3-ממדי. לדוגמא, נטל נגע מוערך בדרך כלל על ידי מדידת שטח החתך של נגע (או באתרים שנבחרו באקראי או באתר של חסימה המרבית). זה מספק ניתוח חלקי של נטל נגע כולל. כל הר טכנולוגיית הדמיה 3 ממדים מספקת פתרון אפשרי לבעיה זו, אך כמה מפתיע גישות מתאימות תוארו. זה יכול להיות בגלל בעיקר לגודל של עורקי עכבר שהם גדולים מדי למיקרוסקופיה confocal פוטון יחיד אבל קטנים מדי עבור הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) 4 ורנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (CT) 5. יישום של vivo לשעבר MRI ו- CT מיקרו למחקר של טרשת עורקים בעכברים מרמזים שהם מציעים רזולוציה מוגבלת, אפילו בעורקים גדולים יחסית. נוסף על כך, הפעמים הרכישה ארוכות יחסית הנדרשלהגביל את התפוקה (ולהגדיל את עלויות סריקה) 4,6.
פיתוח של שיטות הדמיה אופטית חדשות (כגון טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית 3,7 ותמונה-אקוסטי טומוגרפיה 8) מציע הרבה פוטנציאל לשיפור הדמיה של נגעים בעורקים בעכברים. פוטנציאל דומה מוצג על ידי טומוגרפיה אופטית הקרנה (השטחים הכבושים) שפותח על מנת לאפשר ניתוח של עוברי עכברים. השטחים הכבושים נועד דגימות תמונה הנעות בין 0.3-10 ~ מ"מ קוטר 9. הדמיה הילוכים מתעדת את האטימות של מדגם שקוף למחצה לאור הנראה צבעוני ו, יכול לשמש לזיהוי של מבנים אנטומיים. פליטת פליטה רשומות הדמיה של האור הבא עירור באורכי גל ספציפי מאנדוגני (למשל, קולגן, אלסטין) וfluorophores אקסוגניים במדגם. זה יכול גם לספק מידע אנטומי (מאז רכיבי רקמות שונים יכולים להיות שונים בסוג והצפיפות של מיני autofluorescentהווה). בנוסף, חלוקת immunoreactivity או ביטוי גנים ניתן לקבוע תוך השימוש בבדיקות ניאון מתאים 10. לכל אחד ממצבי ההדמיה (שידור או פליטה), אור למכשיר תשלום מצמידים ממוקד כדי לאפשר לכידת תמונת איטרטיבי כמסתובב מדגם (בדרך כלל 400 תמונות במרווחים של 0.9 מעלות). אלה יכולים לשמש לחישוב הנפח בשיטות סטנדרטית טומוגרפיה שיקום (כגון מסונן גב-הקרנה (באמצעות אלגוריתם קונוס) או שחזור איטרטיבי).
וידאו זה מדגים יישום הרומן שלנו של השטחים הכבושים לניתוח 3 ממדים מהירים, כימות וחסכונית של נגעים טרשתיים וneointimal, כפי שתואר לעיל בet al קירקבי. 11. הטכניקה הוצגה להיות מתאים לכימות גודל נגע בשלושה דגמים נפוצים: חוט-פגיעת עורק הירך (i); (Ii) קשירת עורק הירך, (iii) טרשת עורקים נגרם דיאטה ובapolipoprotein E הלקוי (apoE – / -) עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש ניתוח 3 ממדי פוטנציאל גדול להחלפה או הוספה לטכניקות היסטולוגית 2 ממדים שעדיין עומדים בבסיס רוב החקירות של היווצרות נגע עורקים. הנה השטחים הכבושים מוצגים בעורקים בעכברים קטנים (עם עורקי הירך עכברי כנראה מייצגים את כלי הקטנים ביותר שניתן לנתח בהצלחה באמצעות טכניקה זו). גם היא, לעומת זאת, מתאימה לשימוש עם עורקים (ונגעים) ממינים אחרים, כוללים כלי אנושיים בגודל קטן עד בינוני; הקבוצה שלנו השתמשה בהצלחה בטכניקה זו כדי לנתח נגעים באב עורקי ארנב (Bezuidenhout et al;. לא פורסם). השטחים הכבושים מבטיחים ניתוח ומידע מבני גדל מהר יותר בהשוואה להיסטולוגיה המסורתית ויש את היתרון של לא מונע ניתוח בדיעבד של המדגם תוך שימוש בטכניקות שני היסטולוגית וimmunohistochemical.
התמונות הופקו באמצעות השטחים הכבושים נתנו פירוט אנטומי, מראה אתרים של היווצרות נגעואת גודל הנגעים באזורים אלה. העורקים המשמשים בחקירות אלה הם כנראה קרובים לגבול של החלטה לטכניקה ואיכות תמונה נפגעת לכן במידה מסוימת על ידי חפצים (כנראה כתוצאה מחוסר תיאום סיבוב, סליקה שלמה, השתקפות / שבירה בקודקודי agarose ובעיות התמקדות) . למרות זאת, את הפרטים הנדרשים (כלומר, שכבות של קיר הכלי) יישארו להבחין ולכן הטכניקה היא מאוד שימושית עבור הכימות של שכבות בודדות. אכן, תמונות יכולות לכמת במהירות וreproducibly לספק מדידות של נגע וluminal נפח בסעיפים נושאות לוחית של כלי השיט, כמו גם באזורי חתך של הנגע ולומן באתרים נבחרים במדגם. גדול (אב העורקים) והבינוני (הירך, הצוואר, subclavian) עורקים בעכברים – אלה בדרך כלל משמשים לניתוח של היווצרות נגע טרשתית וneotintimal בעכברים – היו הצלחהנותח באמצעות שיטה זו. ואכן יש לנו כיום בשימוש הפלסטיניים הכבושים כדי להדגים את ההשפעה של התערבויות תרופתיות ומניפולציה גנטית בגודל נגע טרשתי וneointimal. לדוגמא, סגר קולט אנדותלין שינה היווצרות נגע neointimal ואילו מחיקה סלקטיבית של אנדותלין B קולט מהאנדותל של כלי הדם לא עשתה 15. בעכברים נוטים טרשת עורקים, מחיקה גנטית של האנזימים 11β-HSD1 16 או 17 galectin 3 הוצגו כדי להקטין את גודל נגעים טרשתיים.
כימות של נפח נגעים היא יתרון ברור של השטחים הפלסטיניים הכבושים. זה נותן אינדיקציה יותר אינפורמטיבי בסך הכל נטל הנגע בעורק 4 מ בדרך כלל שהושג עם שיטות היסטולוגית. ניתוח כולו הנגע מפחית הטיית בחירה ושגיאה שבהכרח תתרחש כאשר חלקים של כלי בדידים נבחרים לניתוח. ייצור פרופילי נגע אורך הוא כוח נוסף של השטחים הכבושים, הודגש על ידי ההשוואה של נגעים הנגרמים על ידי סוגים שונים של פציעה 13,16 (איור 5). לדוגמא, שתי קשירה מלאה וחוט-הכנסה מושרה חסימה כמעט מוחלטת קרובה להסתעפות femero-popliteal. פגיעת חוט, נגעים עם זאת, מיוצרים שהשתרעו לאורך כל אורכו של הקטע שנסרק, ואילו נגעים הנגרמים על ידי קשירת עורקים הצטמצמו במהירות בגודל ונעלמים. דפוס זה עולה בקנה אחד עם נגרמת על ידי החדרת guidewire אנגיופלסטיקה מידה רבה יותר של פציעה. יצירת תוצאות דומות באמצעות סעיפים היסטולוגית היא יקרה, זמן רב ועבודה אינטנסיבית.
היתרונות של השטחים הכבושים כוללים את איכות התמונות שהיא מייצרת ומהירות היחסית ופשטות (שנסרקנו באופן שגרתי 20 כלי ליום). איכות תמונה מעולה מופיעה, או לפחות דומה, לשיטות אחרות ליצירת תמונות 3 ממדי vivo לשעבר (כגון MRI ו- CT מיקרו), yהשטחים הכבושים ואח דורשים זמנים קצרים יותר סריקה (זמן אינטגרציה ללימודים שלנו היו בדרך כלל 1-2sec / תמונה) ופחות יקר. הכנת מדגם משתרעת על פני כמה ימים, אבל דורשת עבודה קטנה, ניתן להכין כלי בקבוצות, וניתן לרכוש נתונים בפגישה אחת. כתוצאה מכך, התפוקה היא גבוהה ואינה דורשת שימוש מורחב של הסורק. חשוב לציין, אינו בעלת האופי ההרסני של השטחים הפלסטיניים הכבושים אומר שזה יכול לשמש כדי לזהות אתרים בעלי עניין לבדיקת immunohistochemical; ובכך להקטין את כמות החיתוך וצביעה הנדרשת. ייתכן שהפיתוח של אולטרה סאונד ברזולוציה הגבוהה יספק שיטה חלופית לכימות נפח של נגעים בעורקים בגודל זה, אבל המחברים אינם מודעים לכל פרסומים המדגימים יישום זה.
אולי באופן לא מפתיע, איכות תמונה בשטחים הכבושים היא נחותה טכניקות מיקרוסקופיות (שיכול, כמובן, יבוצעו רק על דגימות קטנות יותר). חידודים מוצעים לreconstruction של נתונים עשוי להתייחס מגבלה זו על ידי המאפשר שיפור עתיד של איכות תמונת 19,20. דאגה נוספת המתודולוגית היא שעיבוד רקמות משנה מאפיינים של המדגם. לדוגמא טבע lipophilic סוכן הסליקה, נזיל אלכוהול / נזיל בנזואט (באב), עשוי להסיר את השומנים מטרשת עורקים, תוך התייבשות עלולה לגרום להתכווצות לפני (אם כי, כמובן, צעדי התייבשות והסרת שומנים הם גם תכונה של הכנת מדגם להטבעה בשעווה פרפין). באב שימש בחקירה זו כ, בהשוואה לסוכני סליקה הידרופילי (למשל גליצרול 21) היא גורמת רק שינויים קטנים במורפולוגיה.
ישנן מספר אפשרויות לפיתוח וחידוד נוספים של השטחים הפלסטיניים הכבושים, במיוחד בכל קשור למעקב הסדר 3 ממדים של תאי מפתח ואיתות גורמים מעורבים בשיפוץ עורקים. Autofluorescence החזק של רקמת עורקים, שהוא כזהיתרון n בדור של תמונות אנטומיים, לא הרווה בשיטות קיימות של הלבנה 22 ועלול להגביל את השימוש בבדיקות ניאון כדי להעריך דפוסי RNA והפצת חלבון. השימוש בבדיקות colorimetric (למשל β-galactosidase) דמיינו ידי הדמיה שידור עשויות להתגבר על מגבלה זו.
לסיכום, יש פוטנציאל גדול לשטחים הפלסטיניים הכבושים הדמיה 3 ממדים של נגעים בעורקים של אינטימה עכברי. הוא מייצג מראש ניכר על שיטות 2-ממדיות שהן בדרך כלל עבודה אינטנסיבית ולא ביעילות מייצגות סך נפח נגעים. השטחים הכבושים הוא יחסית מהירים, נוח ולא הרסני. התפתחויות חדשות בניתוח תמונה מבטיחות להגדיל את הכח ואת השירות של הטכניקה נוספת.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תעודת סטודנט מאוניברסיטת אדינבורו (NSK) וקרנגי הנאמנות (LL; תכנית Dryerre הנרי) ומימון מקרן הלב הבריטי (PWFH, BRW, DJW; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) וWellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08,314 / ת / 07 / ת). המחברים מודים לתמיכה בעבודתם הניתנת על ידי המרכז במימון BHF של הפרס הצטיינות במחקר למרכז ללב וכלי דם למדע.
המחברים מודים במיוחד לעצה מהפרוף Masataka Sata (אוניברסיטת טוקושימה) וד"ר איגור Chersehnev (בקבוצת ד"ר Ernane 'רייס בהר סיני בית הספר לרפואה) על הקמתה של המודלים כירורגית של נגעי ייצור neointimal. הסרטון שהופק והופץ על ידי Sata et al. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) היה שימושי במיוחד.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | コメント |
| Operating Microscope | Zeiss, Germany | N/A | OPMI Pico i |
| Anaesthetic Machine | Vet Tech, UK | N/A | |
| Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
| Bead Steriliser | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
| Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
| Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
| Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
| Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
| 15000-01 | Cohan-Vannas Spring Scissors | ||
| 11251-35 | Dumont #5/45 Forceps | ||
| 11370-31 | Moria Iris Forceps | ||
| 13008-12 | Halsted-Mosquito Haemostat | ||
| 18050-35 | Bulldog clips | ||
| Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | N/A | |
| Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | N/A | |
| Computer | Dell Inc, UK | N/A | |
| Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
| DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
| NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
| CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapour, liquid |
| Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | N/A | 0.3mg/ml |
| 1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10ml ampoule |
| EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | N/A | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | N/A | |
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
| Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 25, 0000 Units |
| Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
| Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
| Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
| Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
| Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
| Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |
参考文献
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N Engl J Med. 340, 115-126 (1999).
- Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
- McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
- Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
- Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
- Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002 (2009).
- Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu Rev Biomed Eng. 6, 209-228 (2004).
- Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906 (2011).
- Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
- Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
- Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
- Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
- Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
- Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
- Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
- Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
