JoVE Journal > Medicine
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile

Published: May 26, 2015
doi:
10.3791/50627
, , , , , , ,
1University/ BHF Centre for Cardiovascular Science, University of Edinburgh,The Queen’s Medical Research Institute

概要

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Abstract

uygun hayvan modellerinde üretim ve vasküler lezyonların analizi lezyon oluşumu patogenezi ve yeni tedavilerin eylem hakkında önemli bilgiler üreten, kardiyovasküler hastalık araştırmalarına bir köşe taşıdır. Ateroskleroz eğilimli farelerde lezyon indüksiyon cerrahi yöntemler ve diyet modifikasyonu kullanımı dramatik hastalık gelişimi ve yeni tedavilerin potansiyeline katkıda bulunan mekanizmaların anlaşılmasını geliştirdi.

Klasik, lezyonların analizi 2 boyutlu histolojik teknikler kullanılarak ex vivo yapılır. Bu makalede, arteryel lezyonların 3 boyutlu kantitatif optik yansıtma tomografi (OPT) uygulanmasını tarif etmektedir. Bu teknik, tahribatsız olarak, standart histolojik ve immünohistokimyasal analizler bir yardımcı olarak kullanılabilir.

Neointimal lezyonlar fare femur sanat tel yerleştirilmesi veya ligasyonu ile uyarılan edildiAterosklerotik lezyonların iken ery apo-eksikliği olan farelerde bir aterojenik diyet uygulaması ile elde edildi.

Lezyonlar tamamlayıcı histolojik ve immünohistokimyasal analizi ile takip autofluorescent emisyonunun OPT görüntüleme kullanılarak incelenmiştir. Altta yatan vasküler duvar açıkça ayırt lezyonlar OPT. Lezyon boyutu lezyon hacmi ve maksimum enine kesit alanına hesaplanmasına imkan veren, planimetrisi kullanılarak 2-boyutlu bölümler içinde hesaplanmıştır. OPT kullanılarak oluşturulan veriler tekniğin doğruluğunu ve analiz geleneksel yöntemlerle (yerine alternatif daha) bir tamamlayıcısı olarak potansiyel teyit histoloji kullanılarak elde edilen ölçümler ile uyumlu idi.

Bu çalışma aterosklerotik lezyonların ve neointimal görüntülenmesinde OPT potansiyelini gösteriyor. Bu vasküler yeniden rutin 3 boyutlu ölçümü için hızlı, çok gerekli ex vivo tekniği sağlar.

Introduction

arteriyel lezyonların oluşumu kardiyovasküler hastalık 1 ile ilişkili yüksek morbidite ve mortalite merkezindedir. Lezyon oluşumu yaralanması 2 arteriyel dizginsiz bir inflamatuvar yanıt kaynaklandığı düşünülmektedir. Restenotik lezyonlar hızla (stent implantasyonu sonrası, örneğin), akut mekanik hasar takip geliştirmek oysa Aterosklerotik lezyonlar arter duvarına kronik zedelenme yanıt yavaş yavaş oluşturur. Arteriyel lezyonu gelişimine katkıda mekanizmaları genellikle ilgili genetik manipülasyonlar 1 ile kombinasyon halinde, uygun bir hayvan modelinde kullanılması ile önemli ölçüde açıklığa kavuşturulmuştur.

Bu, in vivo ve ex vivo saptanması ve küçük hayvanların lezyon analizi için geliştirilmiş yöntemlere gelişimi ile değişmektedir, ancak lezyon boyutu ve bileşimi analizi, klasik (ex vivo 2 boyutlu dokusu üzerine yoğun bir şekilde bağlı olan <sup> 3). Arteriyel lezyonların Histolojik analiz emek yoğun, zaman alıcıdır ve 3-boyutlu yapının sınırlı bilgi içerir. Örneğin, lezyon yükü genellikle bir lezyonun enine kesit alanı ölçülerek değerlendirilir (ya rastgele seçilen alanlarda veya maksimum tıkanma yerinde). Bu genel lezyon yükünün eksik analizini sağlar. 3 boyutlu görüntüleme teknolojisi bu soruna olası bir çözüm sağlar ama şaşırtıcı birkaç uygun yaklaşım tarif edilmiştir tüm montaj. Bu manyetik rezonans görüntüleme (MRG) 4 ve X-ray bilgisayarlı tomografi (BT) 5 için tek foton konfokal mikroskopi için çok büyük ama çok küçük fare arterlerin boyutu ağırlıklı olarak bağlı olabilir. Farelerde aterosklerotik lezyonların çalışma ex vivo MR uygulanması ve mikro CT hatta nispeten büyük damarlarda sınırlı çözünürlük sunan göstermektedir. Bu eklendi, nispeten uzun kazanım süreleri gerekliverimi sınırlayan (ve tarama maliyetlerini artırmak) 4,6.

(Örneğin optik koherens tomografi 3,7 ve fotoğraf-akustik tomografi 8 gibi) yeni optik görüntüleme yöntemlerinin geliştirilmesi fare arterlerde lezyonların görüntüleme geliştirmek için çok potansiyel sunmaktadır. Benzer bir potansiyel fare embriyoları analizini sağlamak için geliştirilen optik projeksiyon tomografi (OPT) ile gösterilir. OPT çapı 9 ~ 0,3-10 mm arasında değişen görüntü örneklerinde için tasarlanmıştır. İletim görüntüleme polikromatik görünür ışığa yarı saydam örnek opaklığını kaydeder ve anatomik yapıların tanımlanması için de kullanılabilir. Endojen belirli dalga boyunda (örneğin, kolajen, elastin) ve örnek eksojen fluorophores uyarma sonrasında ışık yayılmasının görüntülenmesi kayıt emisyonu. Farklı doku bileşenleri türü ve otofloresan türlerinin yoğunluk farklı olabilir, çünkü bu, aynı zamanda (anatomik bilgi sağlayabilirMevcut). Buna ek olarak, immüno veya gen ifadesi dağılımı, uygun floresan probları 10 kullanımı ile tespit edilebilir. Her iki görüntüleme modu (iletim veya emisyon), ışık örnek dönerken (0.9 ° 'lik artışlarla genellikle 400 görüntü) olarak iteratif görüntü yakalama izin vermek için bir şarj çiftli cihaza odaklanmıştır. Bunlar (örneğin koni algoritması kullanarak filtre arka projeksiyon () veya yinelemeli rekonstrüksiyonu gibi) standart tomografik rekonstrüksiyon yöntemleri ile hacminin hesaplanması için kullanılabilir.

Daha önce Kirkby ve ark., 11'de tarif edildiği gibi bu, video, aterosklerotik ve neointimal lezyon, hızlı bir şekilde ölçülebilir ve uygun maliyetli 3 boyutlu analiz için tercih bizim yeni bir uygulamasını göstermektedir. tekniği üç yaygın olarak kullanılan model lezyon büyüklüğü ölçülmesi için uygun olduğu gösterilmiştir: (i) femoral arter tel yaralanması; Apolipoprotei (ii) femoral arter bağlanması, ve (iii) diyetin neden olduğu aterosklerozunn E eksikliği (apo – / -) fareler.

Protocol

Fare Femoral Arter içinde neointimal Lezyonlarının 1. Cerrahi İndüksiyon Hayvanları kullanarak deneyler ulusal ve kurumsal etik şartlarına uygun olarak yapılmalıdır. Tüm cerrahi uygun aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır. Neointimal lezyonların indüksiyonu Roque ve ark., 12 ve SATA ve ark., 13 tarafından tarif edilen tekniğin bir modifikasyonu kullanılarak elde edilir. Erkek C57BL6 / J fareler tartılır (Yaş 10-12 hafta, ağırlık 25-30 g) indüksiyon odasında% 4-5 izofluran sunarak uyuşturan. Anestezinin sonra, 37 ° C 'de vücut ısısını korumak için ısıtılmış mata fare aktarın. Maske ile izofluran (% 2-3) 'in uygulanmasını devam edin. Anestezi uygun bir düzeyde (ayak tutam tepki olmaması) neden sonra, buprenorfin uygulanması ile analjezik örtü sağlamak (0.1 mg / kg-1). Sonra sırtüstü pozisyon An fare koyunsol hindlimb ventral yüzeyi tıraş d. Popliteal arter ve karın duvarı ile çatallanma arasında, femoral sinir femoral arter ve ven izole etmek künt diseksiyon kullanın, üst hindlimb kasları ortaya çıkarmak için bir kesi yapmak ve. / V lignokain% 1 w kullanarak gerektiği gibi yarayı yıkayın. (Popliteal arter hemen dalı altında) (karın duvarına yakın) ve distal proksimal femoral arter ve kan akışını kontrol etmek için ven etrafında geçici birleşik harfleri (6/0 Mersilk) yerleştirin. Sonra (femoral arter ile şubeye uzak yaklaşık 2-5 mm) popliteal arteri izole ve distale Arter. Popliteal arter altında ikinci bir çözdü bitişik harfleri yerleştirin. Proksimal geçici ligature basınç uygulayarak kanamayı önleyen femoral arter dal hemen distalinde popliteal arterde küçük bir kesi (Arteriyotomi), emin olun. Düz Advance, 0.014 "kılavuz teli çoğaldığınıKarın duvarı yönünde femoral arter boyunca 1-1.5 cm ve 30 saniye (Şekil 1A) yerinde bırakın. Kılavuz teli çıkarın ve bu amaçla yerleştirilen bitişik harfleri kullanarak ve femoral arter tıkamak için özen, arteriotomi üzerinde popliteal arteri Arter. NOT: ligasyon kaynaklı yaralanma için. Intraluminal yaralanma olmadan neointimal biçimlenme femoral veya popliteal arter (Şekil 1B ve 1C) bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. Bu takip 1,1-1,5 adımları elde etmek için. Ancak, arteriyotomi yapmazlar ama ya (i) (adım 1.6 kaçınarak) popliteal arter ile şube noktada femoral arter veya (ii) Arter femoral arterin hemen distalinde popliteal arteri Arter. Sonra adım 1.8 ile devam edin. Geçici bitişik harfler çıkarın süreksiz dış sütür (5/0 Mersilk) ile yarayı kapatmak ve EMLA krem ​​(% 2.5 lidokain,% 2.5 prilokain) uygulanır. Hayvanlar yeniden izin ver bilinç (genellikle 5-10 dk) kazanmak ve onların kafes etrafında serbestçe hareket ediyor emin olun (hafif topallık etkilenen bacakta belirgin olabilir ama bu ameliyattan sonra ilk 2-3 gün içinde çözmelidir) oda tutan dönmeden önce. Fareler ameliyat sonrası tek başına ev sahipliği zorunda değilsiniz. Hayvanlar kadar 3 ay boyunca kurtarmak için izin verin. Küçük lezyonlar 7 gün tel yaralanma sonrası ~ görünmeye başlayacak ve 21-28 gün sonra ~ istikrarlı bir maksimum boyutu ulaşacaktır. Apolipoprotein E Aterosklerotik Lezyonlarının 2. İndüksiyon – / – Fareler 12 hafta boyunca erkek, 6 hafta (evde yetiştirilen) eski ApoE boş fareler için, batı diyet (Araştırma Diyetler, ABD% 0.2 kolesterol) uygulayınız. Aterosklerotik lezyonlar genellikle aort kavsi ve onun büyük dalları (Şekil 2) brüt inceleme üzerine görebilir. 3. Analiz Arter Lezyonları kullanarak Optik Projeksiyon Tomografi (OPT) nt "> NOT: fare femoral arter ve aortik ark örneklerinde lezyonların OPT görüntüleri optik projeksiyon tomografleri kullanılarak elde edilmiştir. % 10 nötr tamponlu formalin, ardından heparinize (10 U / ml) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile terminal anestezi (80 mg / kg sodyum pentobarbital) kapsamında transkardiyak perfüzyon tespit ve kanları tümüyle alınarak fareler öldürülür. Uygun şekilde femoral arter veya aort arkı ve ana dalları (sol karotid arter, sol subklavyen arter, brakiyosefalik gövde), yalıtmak ve yabancı peri-adventisyal malzeme çıkarmak. Gerekli olana kadar% 70 etanol içinde depolamadan önce% 10 tamponlu formalin ile O / N sonrası düzeltme. % 1.5 düşük erime noktalı agaroz gömme arterler, Whatman 113 V kağıt ile ön-filtre edildi. Manyetik OPT her örnek takın mount o doğrultusunda damar ekseni ile siyanoakrilat yapıştırıcı ile monte edilir. Konik şekle aşırı agaroz Trim. En az 12 saat süre ile% 100 metanol içinde kurutmak. Cbenzil alkol ve benzil benzoat karışımı içinde (12-24 saat) daldırılarak emizle kaplar (1: 2 h / h). Kalibre tomografi temizlenir örnekleri yerleştirin. 1024 x 1,024 çözünürlüğü ayarlayın ve ilgi tüm alanı görülebilir sağlayan bir optik büyütme belirler. OPT hacim Z ekseni aynı çözünürlüğe yeniden bir izotropik (yani, 1.024 x 1,024 x 1,024), voksel boyutu ~ 200 mikron. Imar eserler olması muhtemel olduğu gibi bu kararın aşırı tahminini temsil edebilir. O parlak alan, iletim kanalı içinde görüş alanının merkezinde kendi ekseni üzerine döner, böylece örnek konumunu ayarlayın. GFP1 filtre emisyon kanalı (uyarma filtresi 425 nm bant geçiren nm 40 ile; emisyon filtresi: 475 nm uzun geçiş) ise, numune odak ve elde edilen görüntünün dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için pozlama süresini ayarlamak (aşırı doygunluk kaçının). 0.9 ° dönme adım, sadece GFP1 emisyon kanalında gemi tarayın. </ Li> Bitiminde DataViewer yazılımı kullanarak veri toplama kalitesini teyit etmektedir. Tarayıcıdan numune çıkarın. Işlem, normal olarak mum, parafin önce, sonraki histolojik analiz,> 24 saat boyunca% 100 metanol içinde yer örneği sağlamak için. 4. Görüntü İmar ve Analizi Filtre edilmiş geri yansıtma ile Tomografi yeniden yapılandırılması NRecon yazılım veya benzeri kullanılarak gerçekleştirilir. Rekonstrüksiyonları gruplar halinde, sahipsiz yapılabilir. Kaymaları dengeleyebilir ve görüntü yoğunluk seviyelerini ayarlayarak görüntü kalitesini artırmak. DataViewer yazılımını kullanarak görüntü rekonstrüksiyon kalitesini kontrol edin. Analiz için numune uygun bölümü belirlenmesi. Lümen boyutları kaydedildi isteniyorsa gemiler arasında tutarlı Bu uzunluk tutun. El her 50 yeniden inşa kesitler içinde 1 uygun sınır izleme tarafından lezyonların taslağını tanımlayın. Bilgisayar tarafından oluşturulan interpolations doğru olduğundan emin olmak için her Interleaved kesite edin. Gerektiğinde el ile sınır ayarlayın. Yalnızca lezyon seçilir, böylece gri-seviyeli eşiğini ayarlayın ve ölçüm veri ihracat. Her tarama için, lezyon içeren bir ilgi dikey bölgesini tanımlamak ve medya ve neointimaya arasındaki sınırı iz (yani., Internal elastik lamina pozisyonu) her 50 inci tarama hattı için. Yazılımda interleaved tarama hatları için intima / media sınırları katmak ve doğrulamak ve gerektiğinde uygun düzeltin. Daha fazla kademeli bu beyaz piksel neointima temsil siyah piksel lümen temsil ettiği bir ikili görüntü setini üretmek için elle tanımlanmış yoğunluğu eşiğine üç boyutlu hacmi tanımlanır. Alınan ölçümler şunlardır: toplam lezyon hacmi (nesne hacmi), lümen hacmini (toplam hacim – nesne hacmi) ve lezyonun ve çapraz mezhep lümen dağılımıçalışılan kabın eksenel uzunluğu boyunca uğratarak alanı.

Representative Results

Sağlıklı (lezyonsuz) fare femoral arterlerin ön tarama (n = 5) iletim görüntüleme yararlı görüntüleri vermedi gösterdi. Yayılan sinyalin hiçbir absorbans / saçılma olduğu gibi bu iletim imaging.However için çok şeffaf (yerine çok opak) olma temizlendi arterlerin bir sonucuydu, bu emisyon görüntüleme için faydalıdır. Bunun aksine, femoral arter (14 elastin için 410 nm eksitasyon zirve ile tutarlıdır) 405-445 nm'de uyarma sonrasında büyük sinyal ile emisyon kanalına güçlü autofluoresce. Bu görüntülerden yeniden 2 boyutlu dilim açıkça lümenin ve adventisyanın ve lümen medya ayırt. Murin femoral arter 28 gün telsiz sonra (n = 6) ya da ligasyonu (n = 5) neden olduğu hasarı neointimal koyulaştırıcı olmayan tomografik salım çıkıntılar belirgindi (Şekil 3A) hasat edildi. Yeniden 2-DIMENS olarakional dilimleri, eş neointimal lezyonlar zayıf emisyon (Şekil 3B ve Şekil S1) tarafından medya ayırt edilebilir. Aterosklerotik farelerin OPT emisyon arkus tüm montaj örnekleri görüntüleri ve ana dalları (n = 8) ön görülen anatomik dağılım ile özdeşleşmiş lezyonlar (örn., Aort kavsi, brakiyosefalik arter ve kökenleri daha az eğrilik sol karotis ve sol subklavian arterlerin (Şekil 4A). kesit görüntüleri bu (Şekil 4B, S2 ve S3 Rakamlar), tipik olarak eksantrik lezyonlar ve kolayca medya ve lümen ayırt olduğunu göstermiştir. OPT aşağıdaki histolojik analiz için İşleme arterler başarıyla histolojik (Amerika Birleşik Devletleri Trichrome, Picr kullanılarak boyanan kesitler ile OPT tahribatsız doğa doğruladıosirius kırmızı) ve immünohistokimyasal (α-SMA, Mac-2) teknikleri (Şekil 3C ve 4C). OPT ile lezyon boyutu ölçümü aynı arter 11 alınan histolojik kesitlerin görüntü analizi kullanılarak elde edilen ölçümler ile uyumlu olduğu gösterilmiştir. Telsiz (R 2 = 0.92) ve ligasyon kaynaklı (R 2 = 0.89) neointimal lezyonlar ve aterosklerotik plakların (R = 0.85 2) için OPT ve lineer regresyon ile yakından ilişkili histoloji ile elde edilen lezyon alanının planimetrik ölçümleri. OPT önemli bir faydası 3 boyutlu analizini sağlamak için yeteneğidir. Bu teknikle lezyonların hacimsel ölçümü geliştirerek, telsiz lezyon hacimleri kaydetmek başardık (0,1100 ± 0,0091 mm, 3, n = 6) ve ligasyon-yaralı femoral arter (0,0200 ± 0.0089 mm 3, n = 5) ve aynı zamanda aterosklerotik brakiyosefalik arterlerde (0.180 ± 0.018 mm 3; n = 8). Ölçümler son derece tekrarlanabilir (sırasıyla varyasyon% 5,4 katsayıları,% 11.4 ve% 4.8, n = 4) olan lezyonun her türlü. Tel hasarlı damarların neointimal lezyon önceki açtığı hasar daha yüksek derecede uyumlu ligasyon ile üretilen, daha büyük (p <0.0001) vardı. oluşturulan veriler de (Şekiller bkz S1 – S3) lezyon profillerinin (Şekil 5) olarak ifade edilir ve dinamik, nitel değerlendirme için render olabilir. Bu yaklaşım açıkça farklı yaralanma prosedürlerine yanıt lezyon oluşumu kapsamını gösterdi ve yaralı damarlarda lezyon oluşumu düzensiz dağılımı vurguladı. Şekil 1: fare femoral arter lezyon oluşumunu başlatmak için Yöntemler & #.160; popliteal arter bir arteriyotomi vasıtasıyla femoral artere kılavuz tel, bir anjiyoplasti (A) retrograd yerleştirme hasarı ve endotelyumun çıkarılması germek için yanıt olarak lezyon oluşumunu teşvik eder. Kan akışı, yaralı damar bölgesinden bölümü üzerine yeniden kurulur. Intraluminal streç, soyulma ya da kan akışına kesinti olmadan (B) neointimal proliferasyon femoral veya femoral arter bifurkasyonunun hemen distalinde popliteal arter ya bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. (C) daha şiddetli olmayan denuding yaralanma / çoğalması tepkisi femoral arter dal noktası üzerinde femoral ve popliteal arterler hem bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. Bu teknik aynı zamanda femoral arterin distal kısmına kan akışını engeller. Şekil 2:. 12 hafta arkus ve ana dallarında lezyon birikimi karakteristik desen geliştirmek için fare arkus içinde aterom karakteristik çökelme eğilimli Ateroskleroz (Apolipopotein E yoksun fareler), yüksek kolesterol batı diyet ile beslenen. Gösterildiği gibi, lezyonlar aort arkı, brakiyosefalik arterde, bir mikroskop altında brüt muayene ile, görünür (oklar), ve sol karotis arter ve sol subklavyen arter deliklerinin içinde. Şekil 3:. Sol femoral arter ligasyonu aşağıdaki Lezyon oluşumu (netlik artırmak için ters – karanlık bölgeler daha güçlü emisyon karşılık) (A) Sigara tomografik floresans emisyon görüntüleri intimal kalınlaşma tanımlanmasına izin (kırmızı arrowhereklamlar). (B) Farklı vasküler bölgeler ve lümen tomografik rekonstrüksiyonlarında ayırt edilebilir. (C) histolojik analizi (Amerika Birleşik Devletleri trichrome) OPT kullanılarak elde görüntüleri ile açık benzerlik vurguluyor. (AC) Ölçek çubukları 200 mm'dir. Kirkby ark. (AC) 11 Ölçek çubukları uyarlanmıştır 200 mikron bulunmaktadır. Şekil 4:. Aortik arkın (koyu bölgeler, böylece berraklığını geliştirmek, daha güçlü bir emisyon göstermektedir, böylece ters) ateroskleroz eğilimli farelerin aortik arkında ateromanın Görüntüleme (A) ateromlar (kırmızı ok başları), hali hazırda olmayan tomografi belirgindir siteleri (Şekil 2) ışık mikroskobu altında incelenmesi ile ateroma-yatak olarak öngördü. (B) dağılım Bu model tomografik cr teyit edilmiştiross-kesitler. (C) histolojik (Amerika Birleşik Devletleri trichrome) boyama lezyon analizi, geleneksel yaklaşımlara OPT tamamlayıcı doğasını birkaç farklı antikorları vurgulayan kullanarak yakın tomografik kesitler ile benzerlik ve immunohistokimyasal gösterir. (A-B) 'de Ölçek çubukları 1 mm; (C) 'deki ölçek çizgisi 250 mm. RSA, sağ subklavian arter; RCA, sağ karotid arter; LCA, sol karotid arter; LSA, subklavian arter sol; BCA, brakiyosefalik arter; AAo, asendan; Dao, inen aorta. Kirkby ark uyarlanmıştır. 11 Şekil 5: lezyon ve lümen profillerinin analizi arteriyel yaralanma farklı yöntemler cevaben neointimal çoğalma ölçüde değişen belirtir Optik projeksiyon tomografi lezyonu izin verir ve lümen kesit ÖLÇME çapraz.ts femoral arter boyunca mesafeye karşı çizilecek. Bu açık bir şekilde, toplam bağlanma (C), ligasyon yerinde tam t üretir ancak lezyon arter boyunca kadar uzanmaz, oysa bir zarar görmemiş arter (A), kısmi ligasyonu (B) ile karşılaştırıldığında, küçük, nispeten ayrı lezyonlar, göstermektedir . Lumen kablo hasarı (D) hemen hemen tamamen numunenin uzak kısmını emen ve arter taranmış bölümünün bütün uzunluğu boyunca uzanan bir lezyon verir. Kirkby ark uyarlanmıştır. 11 Şekil S1. Ligasyon yaralanmasını izleyen bir fare femoral arterden alınan kesit görüntüleri Hareketli rekonstrüksiyonu. Animasyonlu resim Bu tip hem kalitatif ve kantitatif analiz için yararlıdır. Animasyon arterin distal bölümlerine proksimal bir tıkayıcı neointimaya kademeli gelişimini hareket ettikçe, disklumen ve ortamdan ernible, hali hazırda belirgindir. Yan dallar kolaylıkla tespit edilebilir ve belirgin lümen tıkanıklığı ve boyutu lezyon arttıkça arterin dışa biçimlenme vardır. Ligasyon site ulaşıldığında geminin tam tıkanma meydana gelir. Kirkby ark uyarlanmıştır. 11 .. (- Ilk göründüğünde sol) ve azalan (sağ) aort Şekil S2, bir ateroskleroz eğilimli fare aort arkın kesit görüntüleri Hareketli yeniden canlandırma yükselen kesitleri ile başlar. Küçük lezyonlar arkus yönünde tarama hamle olarak çıkan aorta görünür. Görüntüler daha sonra brakiyosefalik (solda), sol karotis (orta) ve sol subklavian (sağ) arterlerin ağır lezyonlu ostiumları göstermek için kemer dolaşmak. Tarama Bu dalların boyunca distal hamle olarak lezyonlar yavaş yavaş subc ilk azaltmak ve yoklavian arter, daha sonra karotid ve son olarak brakiyosefalik arter. İlginçtir ki, bu geminin gibi akış bölücü üzerine brakiyosefalik arter hamlede lezyon sağ karotis ve sağ subklavian arterlerin ayrılır. Kirkby ark uyarlanmıştır. 11 Şekil S3. Animasyon, bir ateroskleroz eğilimli fare aort arkın hacim görüntü render. Optik projeksiyon tomografi bir apolipoprotein E eksik fare aortik arkında lezyon dağılımını gösteren bu durumda, 3 boyutlu görüntülerin nesil verir. (A) Aterom (sol karotis ve subklavian arterlerin çıkımının ve arkus daha az eğrilik, brakiyosefalik arter boyunca) beklenen siteler mevcuttur. Orijinal görüntünün üzerine bindirilmiş zaman kesitler taşıyan (B) Segmentasyon ve (kırmızı ile gösterilen) lezyon oluşturma plakların dağılımını vurguluyor.Kirkby ark uyarlanmıştır. 11

Discussion

3-boyutlu analiz değiştirilmesi veya hala arteriyel lezyon oluşumu soruşturmaların çoğunluğu temelini 2 boyutlu histolojik teknikler ekleyerek için büyük bir potansiyele sahiptir. İşte OPT (muhtemelen bu tekniği kullanarak başarılı bir şekilde analiz edilebilir en küçük gemiler temsil fare femoral arterler ile), küçük fare arterlerde gösterilir. Ayrıca, bununla birlikte, damar (ve lezyonlar), küçük ve orta büyüklükteki gemiler, insan da dahil olmak üzere diğer türlerden gelen ile kullanım için uygundur; Grubumuzun başarıyla tavşan aort lezyonları analiz tekniği kullandı (Bezuidenhout ark;. yayımlanmamış). OPT geleneksel histoloji ile karşılaştırıldığında daha hızlı analiz ve artan yapısal bilgiler vaat ve histolojik ve immünohistokimyasal hem tekniklerini kullanarak numunenin sonraki analizlere engellemediğini avantajına sahiptir.

OPT kullanılarak üretilen görüntüler lezyon oluşumu siteleri gösteren anatomik detay verdive bu alanda lezyon boyutu. Bu araştırmalarda kullanılan arterler nedenle (muhtemelen rotasyon hiza, eksik takas, yansıma / kırılma agaroz köşelerinde ve odaklama sorunlardan kaynaklanan) eserler belirli bir dereceye kadar bozulur tekniği ve görüntü kalitesi için çözünürlük sınırı muhtemelen yakın . Buna rağmen, gerekli bilgileri (örneğin, damar duvarının tabakalar) ayırt edilebilir kalır ve bu nedenle, teknik, tek tek tabakaların ölçümü için son derece yararlıdır. Gerçekten de, resim örneğinde seçilen alanlarda kabın plaka taşıyan bölümlerde lezyon ve luminal miktarlarının yanı sıra, lezyonun kesit alanları ve lümen sağlamak için hızlı ve yeniden üretilebilir bir miktarı olabilir. Büyük (aort) ve orta ölçekli (femur, karotid, subklavyen) sıçangil arterler – bu, genellikle farelerde aterosklerotik lezyon oluşumu ve neotintimal analizi için kullanılan – başarılı idiBu yöntemi kullanarak analiz edildi. Nitekim biz şimdi aterosklerotik lezyon ve neointimal boyutuna farmakolojik girişimler ve genetik manipülasyon etkisini göstermek için OPT kullandık. Vasküler endotel endotelin B reseptörü seçici silme 15 vermedi oysa Örneğin, endotelin reseptör blokajı neointimal lezyon oluşumu değişmiş. Ateroskleroz eğilimli farelerde, genetik enzimlerin silinmesi 11β-HSD1 16 veya galektin 3 17 aterosklerotik lezyonların boyutunu azaltmak için gösterildi.

Lezyon hacmi miktarının OPT bariz bir faydadır. Genellikle histolojik yöntemlerle elde edilen daha bir arter 4 toplam lezyon yükünün daha detaylı şekilde göstermektedir. Tüm lezyonu analiz eden bir geminin ayrık bölümleri analiz için seçilen zaman kaçınılmaz oluşacak seçim yanlılığı ve hatayı azaltır. Boyuna lezyon profillerinin üretimi OPT bir başka gücüYaralanma 13,16 farklı (Şekil 5) tarafından uyarılan lezyonlar açısından vurgulanmıştır. Örneğin, tam ligasyonu ve tel yerleştirme hem femero-popliteal çatallanma yakın neredeyse tam tıkanıklık kaynaklı. Tel yaralanması, arter ligasyonu ile uyarılmış lezyonlar hızlı küçülmüş ve yok ise, taranan bölümünün bütün uzunluğu boyunca uzanan, ancak, üretilen lezyonlar. Bu model, anjiyoplasti, kılavuz telin yerleştirilmesi kaynaklanan yaralanma büyük ölçüde uyumludur. Histolojik kesitler kullanılarak benzer sonuçlar üreten pahalı, zaman alıcı ve emek yoğun.

OPT avantajları (biz rutin günde 20 gemileri taranmış var) ürettiği görüntülerin kalitesini ve göreceli hız ve basitlik bulunmaktadır. Görüntü kalitesi 3 boyutlu görüntüler oluşturmak için diğer yöntemlere üstün veya en azından kıyaslanabilir görünür ex vivo, y (örneğin MR ve BT mikro gibi)et OPT (çalışmalarımız / resim genelde 1-2sec oldu entegrasyon süresi) ve daha az pahalı kısa tarama süreleri gerektirmektedir. Örnek hazırlama birkaç gün boyunca uzanır, ancak çok az iş gücü, gemi gruplar halinde hazırlanabilir gerektirir ve verileri tek bir oturumda elde edilebilir. Sonuç olarak, çıktı yüksektir ve tarayıcı genişletilmiş kullanımını gerektirmez. Önemlisi, OPT tahribatsız doğası immünohistokimyasal inceleme için ilgi siteleri belirlemek için kullanılabileceği anlamına gelmektedir; Bu şekilde kesme miktarını azaltmak ve gerekli boyama. Bu yüksek çözünürlüklü ultrason gelişme arterlerde lezyonlar bu boyutta hacimsel ölçümü için alternatif bir yöntem sağlamak olasıdır, ancak yazarlar bu uygulamayı gösteren herhangi yayınların farkında değiller.

Belki şaşırtıcı, OPT görüntü kalitesi (tabii ki, yalnızca küçük örnekler üzerinde yapılabilir) mikroskobik tekniklerine geridedir. Önerilen iyileştirmeler reconstructio içinVerilerin n görüntü kalitesi 19,20 gelecekteki gelişme izin vererek bu sınırlama hitap edebilir. Başka bir metodolojik endişe doku işleme örneğinin özelliklerini değiştirir olmasıdır. Örneğin temizleme ajanı lipofilik doğası, benzil alkol / benzil benzoat (BABB), tabii ki, dehidrasyon ve lipid temizleme adımları da bir özelliği vardır, her ne kadar önceden dehidrasyon (daralmasına neden olabilir iken, aterosklerotik lezyonlar lipid çıkarmak olasıdır parafin gömme için numune hazırlama). BABB (örneğin, gliserol 21), morfoloji sadece küçük değişiklikler olur hidrofilik temizleme maddeleri ile karşılaştırıldığında, bu araştırmada kullanılmıştır.

Özellikle kilit hücrelerin 3 boyutlu düzenleme, izleme ve arteriyel yeniden rol oynayan faktörleri sinyalizasyon konusunda OPT daha da gelişmesi ve arıtma için çeşitli olasılıklar vardır. örneğin a, atardamar dokusu güçlü otofloresansı,Anatomik görüntülerin nesil n avantaj, ağartma 22 mevcut yöntemlerle söndürülür değildir ve RNA ve protein dağıtım modellerini değerlendirmek için floresan probların kullanımını kısıtlayabilir. İletim görüntüleme ile görüntülendi kolorimetrik probların kullanımı (örneğin β-galaktosidaz) bu sınırlamanın üstesinden gelebilir.

Sonuç olarak, OPT fare intimanın lezyonların 3 boyutlu görüntüleme için büyük bir potansiyele sahiptir. Genel olarak emek yoğun ve etkili bir şekilde, toplam lezyon hacmini temsil etmez 2 boyutlu yöntemler üzerinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. OPT nispeten hızlı, rahat ve tahribatsız. Görüntü analizi yeni gelişmeler daha da tekniğin gücünü ve yarar artırmak için söz veriyorum.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

(; Henry Dryerre şeması LL) ve finansman İngiliz Kalp Vakfı (PWFH, BRW, DJW; Bu çalışma Edinburgh Üniversitesi (NSK) ve Carnegie Trust studentships tarafından desteklenen RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) ve Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). Yazarlar Kardiyovasküler Bilim Merkezi'nin Araştırma Mükemmellik ödülü BHF-finanse Merkezi tarafından sağlanan çalışmaları için desteklemek için minnettarız.

Yazarlar neointimal lezyon üretiminin cerrahi modellerinin kurulmasına ilişkin Profesör Masataka Sata (Tokushima Üniversitesi) ve (Mount Sinai Tıp Okulu Dr Ernane Reis'in grubunda) Dr. Igor Chersehnev tavsiye için özellikle minnettarız. Video üretilen ve SATA ve arkadaşları tarafından sunulmuştur. (http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) özellikle yararlı olmuştur.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number コメント
Operating Microscope Zeiss, Germany N/A OPMI Pico i
Anaesthetic Machine Vet Tech, UK N/A
Fluovac Harvard Apparatus UK 340387
Fluosorber Harvard Apparatus UK 340415
Bead Steriliser Fine Science Tools, UK 1800-45
Heated Mat Fine Sceince Tools, UK 21061-10
Balance Mettler Toledo MS1602S PB1502 or equivalent
Sutures Ethicon, UK 5/0 Mersilk
Guidewire Cook Inc, USA C-PMS-251 0.014”
Suture Silk Fine Science Tools, UK 18020-60 6/0 Mersilk
Surgical Tools Fine Science Tools, UK 14058-09 Toughcut Iris scissors
15000-01 Cohan-Vannas Spring Scissors
11251-35 Dumont #5/45 Forceps
11370-31 Moria Iris Forceps
13008-12 Halsted-Mosquito Haemostat
18050-35 Bulldog clips
Bioptonics 3001 Tomograph  Bioptonics, UK N/A
Magnetic OPT Mount Bioptonics, UK N/A
Computer Dell Inc, UK N/A
Peristaltic pump Gilson F117606 Minipuls 3
DataViewer software  Skyscan, Belgium v.1.4.4
NRecon software  Skyscan, Belgium v.1.6.8
CTan software Skyscan, Belgium v.1.12
Isoflurane Merial Animal Health Ltd, UK AP/Drugs/220/96 100% Inhalation vapour, liquid
Medical Oxygen BOC Medical, UK UN1072
Vetergesic Alstoe Animal Health Ltd, UK N/A 0.3mg/ml
1% Lignocaine Hamlen Pharmaceuticals, UK LD1010 10ml ampoule
EMLA Cream Astra Zeneca, UK N/A
Sodium Pentobarbital Ceva Animal Health Ltd, UK N/A
Western Diet Research Diets, USA D12079B 0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline Sigma UK P4417
Heparin (Mucous) Leo Laboratories, UK PL0043/003GR 25, 0000 Units
Neutral Buffered Formalin Sigma, UK HT501128 10%
Ethanol VWR BDH Prolabo, UK 20821.33 Absolute AnalaR 
Agarose Invitrogen, UK 16020050 Low melting point
Filter Paper GE Healthcare, UK 113v Whatman
Cyanoacrylate adhesive Henkel, UK 4304 Loctite
Benzyl alcohol Sigma, UK B6630
Benzyl benzoate Sigma, UK 402834
Methanol VWR BDH Prolabo, UK 20856.296 100%
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  2. Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N Engl J Med. 340, 115-126 (1999).
  3. Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
  4. McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
  5. Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
  6. Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
  7. Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002 (2009).
  8. Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302 (2010).
  9. Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
  10. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu Rev Biomed Eng. 6, 209-228 (2004).
  11. Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906 (2011).
  12. Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
  13. Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
  14. Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
  15. Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
  16. Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
  17. Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
  18. Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
  19. Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
  20. Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
  21. Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
  22. Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).

タグ

Optical Projection Tomography3D QuantitationArterial LesionsMiceAtherosclerosisNeointimal LesionsWire-insertionLigationApoE-deficientHistologyImmunohistochemistryVascular Remodeling

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Kirkby, N. S., Low, L., Wu, J., Miller, E., Seckl, J. R., Walker, B. R., Webb, D. J., Hadoke, P. W. F. Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography. J. Vis. Exp. (99), e50627, doi:10.3791/50627 (2015).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image