Генерация и 3-мерная Количественное поражений артерий у мышей, используя оптической проекционной томографии
概要
Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.
Abstract
Генерация и анализ сосудистых поражений в соответствующих моделях животных является краеугольным камнем исследований в сердечно-сосудистых заболеваний, создавая важную информацию о патогенезе формирования поражения и действия новых методов лечения. Использование атеросклероза подверженных мышей, хирургических методов индукции поражения, и диетических изменений значительно улучшилось понимание механизмов, которые способствуют развитию болезни и потенциал новых методов лечения.
Классически, анализ поражений выполняется экс виво с помощью 2-мерных гистологические методы. Эта статья описывает применение оптической проекционной томографии (OPT) в 3-мерном количественного артериальных поражений. В этот метод является неразрушающим, он может быть использован в качестве дополнения к стандартным гистологических и иммуногистохимических анализов.
Неоинтимальная поражения были вызваны проволоки вставки или перевязки бедренной мыши искусстваERy время атеросклеротических поражений были получены путем введения атерогенной диете в ароЕ-дефицитных мышей.
Поражения были изучены с помощью OPT изображений эмиссии autofluorescent затем дополнительного гистологического и иммуногистохимического анализа. OPT четко отличать поражения от основной сосудистой стенки. Размер повреждения была рассчитана в 2-мерных сечений с помощью планиметрии, что позволяет рассчитать объем поражения и максимальной площадью поперечного сечения. Данные, полученные с помощью OPT согласуются с измерениями, полученными с использованием гистологии, подтверждающие достоверность методики и ее потенциал в качестве дополнения (а не альтернативы) к традиционным методам анализа.
Эта работа демонстрирует потенциал ОПТ для визуализации атеросклеротических поражений и неоинтимальная. Это обеспечивает быстрый, столь необходимую экс естественных условиях технику для обычного 3-мерного количественного сосудистого ремоделирования.
Introduction
Формирование артериальных поражений центральной высокой заболеваемости и смертности, связанной с сердечно-сосудистыми заболеваниями 1. Образование Поражение считается быть вызвано неограниченной воспалительной реакции с повреждением артерии 2. Атеросклеротических поражений образуют медленно в ответ на хроническим повреждением к артериальной стенки, тогда как restenotic повреждения развиваются быстро после острого механического повреждения (например, после имплантации стента). Механизмы, которые способствуют развитию артериальных повреждений были существенно уточнены с использованием соответствующих моделей животных, часто в сочетании с соответствующими генетических манипуляций 1.
Анализ размера повреждения и состава классически значительной степени зависит от естественных экс, 2-мерном гистологии (хотя эта ситуация меняется с развитием более совершенных методов для в естественных условиях и экс естественных условиях обнаружения и анализа повреждений в небольших животных <SUP> 3). Гистологический анализ артериальных поражений является трудоемким, отнимает много времени и обеспечивает ограниченную информацию о 3-мерной структуре. Например, нагрузка поражения обычно оценивали путем измерения площади поперечного сечения поражения (либо в случайно выбранных местах или в месте максимальной окклюзии). Это обеспечивает неполную анализ общего бремени поражения. Всего монтажа 3-мерного изображения технология обеспечивает возможное решение этой проблемы, но на удивление мало подходящие подходы были описаны. Это может быть связано преимущественно с размером артерий мыши, которые являются слишком большими для однофотонной конфокальной микроскопии, но слишком мал для магнитно-резонансной томографии (МРТ) 4 и рентгеновской компьютерной томографии (КТ) 5. Применение экс естественных условиях МРТ и КТ микро к изучению атеросклеротических поражений у мышей предполагает, что они предлагают ограниченное разрешение, даже в относительно крупных артерий. В дополнение к этому, требуется сравнительно длительное время приобретенияограничить пропускную (и увеличить расходы сканирования) 4,6.
Разработка новых методов оптической визуализации (например, оптической когерентной томографии 3,7 и фото-акустической томографии 8) предлагает большой потенциал для улучшения визуализации поражений в мышиных артериях. Аналогичная потенциал показано оптической проекционной томографии (OPT), которая была разработана, чтобы позволить анализ эмбрионов мыши. ОПТ был разработан, чтобы образцов изображений, начиная от ~ 0.3-10 мм в диаметре 9. Передача изображений регистрирует непрозрачность полупрозрачного образца полихроматического видимого света и, могут быть использованы для идентификации анатомических структур. Излучение записи изображений излучение света при возбуждении на конкретных длин волн от эндогенных (например, коллагена, эластина) и экзогенных флуорофоров в образце. Это может также обеспечить анатомическую информацию (так как различные компоненты ткани могут отличаться по типу и плотности autofluorescent видовнастоящее время). Кроме того, распределение иммунореактивности или экспрессии гена может быть определена с использованием соответствующих флуоресцентных зондов 10. Для любой режим изображения (передачи или излучения), свет фокусируется на прибор с зарядовой связью, чтобы итерационный захват изображения в качестве образца вращается (обычно 400 изображений в 0,9 ° с шагом). Они могут быть использованы для расчета объема с помощью стандартных методов реконструкции томографических (например, отфильтрованной задней проекции (с использованием алгоритма конус) или итеративного реконструкции).
Это видео демонстрирует нашу новую заявку на ОПТ для быстрого, количественно и экономически эффективным 3-мерного анализа атеросклеротических поражений и неоинтимы, как описано ранее в Киркби др. 11. Техника была показана, чтобы быть пригодным для количественного размера поражения в трех наиболее часто используемых моделей: (I) бедренной артерии провод-травмы; (II) бедренной артерии лигирование, и (III) диеты, вызванной атеросклерозом, в apolipoproteiП Е дефицит (ароЕ – / -) мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
3-мерное анализ имеет большой потенциал для замены или добавления к 2-мерных гистологических методов, которые по-прежнему лежат в основе большинства исследований формирования артериальной поражения. Здесь OPT показано в небольших мышиных артерий (с мышиных бедренных артерий, вероятно, представляющих мельчайших сосудов, которые могут быть проанализированы успешно используют эту технику). Это, однако, также пригодны для использования с артерий (и поражений) от других видов, в том числе малых и средних размеров человека сосудов; наша группа успешно использовала технику, чтобы проанализировать поражений в аорте кролика (Безуиденхоут др;. не опубликовано). OPT обещает более быстрое анализ и повышенную структурную информацию по сравнению с традиционной гистологии и имеет то преимущество, не предотвратить дальнейший анализ образца с использованием гистологических и иммуногистохимических и методы.
Изображения, полученные с использованием OPT дал анатомическое деталь, с указанием местонахождения формирования пораженияи размер повреждений в этих областях. Артерии, используемые в этих исследованиях, вероятно, близки к пределу разрешения для техники и качества изображения, поэтому нарушение в определенной степени от артефактов (вероятно, в результате вращения смещения, неполной очистки, отражения / преломления в агарозном вершин и проблемы фокусировки) , Несмотря на это, детали, необходимые (т.е. слои стенки сосуда) остается заметной и, следовательно, этот метод является чрезвычайно полезным для количественного определения отдельных слоев. В самом деле, изображения могут быть быстро и воспроизводимо количественно, чтобы обеспечить измерения поражения и объема просвета в бл подшипников секций судна, а также кросс-секционные области поражения и просвет на отдельных участках в образце. Большой (аорта) и средних (бедренная, сонной, подключичной) мышиные артерии – те, которые обычно используются для анализа атеросклеротического и neotintimal формирования поражения у мышей – были успешноанализировали с помощью этого метода. Действительно, мы в настоящее время используется OPT, чтобы продемонстрировать эффект фармакологических вмешательств и манипуляций с генами на атеросклеротической и неоинтимальной размера повреждения. Например, блокада рецепторов эндотелина изменены образование неоинтимы поражения, тогда как селективный удаление рецептора эндотелина B из сосудистого эндотелия не так 15. При атеросклерозе, склонной мышей, генетическими исключение из ферментов 11β-HSD1 16 или 17 галектин 3 было показано, чтобы уменьшить размер атеросклеротических поражений.
Количественное объема поражения является очевидным преимуществом ОПТ. Это дает более информативный признак общего бремени поражения в артерии 4, чем обычно, полученной с гистологических методов. Анализируя весь поражение уменьшает смещение отбора и ошибки, которые неизбежно будут возникать при дискретных разделы судна выбраны для анализа. Производство продольных профилей поражение дополнительно прочность OPT, Подчеркивается сравнению поражений, вызванных различными видами травм 13,16 (рисунок 5). Например, как полная лигирование и провод-вставки индуцированной почти полную окклюзию близко к femero-подколенного бифуркации. Травмы провода, однако, полученные поражения, что расширенные по всей длине сканируемого участка, тогда как повреждений, вызываемых артериальным лигирования быстро уменьшается в размере и исчезает. Эта модель согласуется с большей степени повреждений, вызванных введением ангиопластики проводника. Создание подобных результатов с помощью гистологических дорого, отнимает много времени и трудоемким.
Преимущества OPT включают качество изображений производит и его относительную скорость и простоту (мы обычно сканируются 20 судов в сутки). Качество изображения появляется превосходит, по крайней мере, сопоставимы, с другими методами для генерации 3-мерных изображений экс виво (например, MRI и микро- КТ), уи др ОПТ требуется меньше времени сканирования (время интеграции для наших исследований было, как правило, 1-2sec / изображения) и дешевле. Подготовка образца на протяжении нескольких дней, но требуется немного труда, сосуды, могут быть получены в партиях, и данные могут быть получены в одной сессии. Следовательно, пропускная способность высока, и не требует длительного использования сканера. Важно отметить, что неразрушающий характер OPT означает, что могут быть использованы для идентификации сайтов, представляющих интерес для иммуногистохимического исследования; Таким образом, уменьшая количество резки и окрашивания требуется. Вполне возможно, что развитие высоких ультразвука разрешением обеспечит альтернативный способ объемного количественного поражений артерий в этот размер, но авторы не знают о каких-либо публикаций, которые демонстрируют это приложение.
Неудивительно, что качество изображения на ОПТ уступает микроскопических методов (которые могут, конечно, быть выполнены только на небольших образцов). Предлагаемые уточнения к reconstructioн данных может решить эту ограничение, позволяя в будущем улучшение качества изображения 19,20. Другой методологический беспокоит то, что обработка ткани изменяет характеристики образца. Например липофильный характер Осветлитель, бензиловый спирт / бензилбензоат (Babb), вероятно, чтобы удалить липидов из атеросклеротических поражений, в то время как до обезвоживание может привести к усадке (хотя, конечно, обезвоживание и удаление липидов шаги также особенность подготовка образцов для встраивания в парафин). Babb был использован в данном исследовании в качестве, по сравнению с гидрофильными клиринговых агентов (например, глицерин 21) это вызывает лишь небольшие изменения в морфологии.
Есть несколько возможностей для дальнейшего развития и совершенствования ОПТ, особенно в отношении отслеживания 3-пространственное расположение основных элементов и факторов, участвующих в артериальной реконструкции сигнализации. Сильный флуоресценции артериальной ткани, которая является такимп преимуществом в генерации анатомические изображения, не гасили существующих методов отбеливания 22 и может ограничивать использование флуоресцентных зондов для оценки РНК и белка распределения модели. Использование колориметрических датчиков (например, β-галактозидазы) визуализировали с помощью визуализации передачи может преодолеть это ограничение.
В заключение, ОПТ имеет большой потенциал для 3-мерного изображения поражений в интиме артерий мышиных. Она представляет собой значительный шаг вперед на 2-мерных методов, которые, как правило, трудоемкий и не эффективно представляют общий объем поражения. ОПТ сравнительно быстро, удобно и неразрушающего. Новые разработки в области анализа изображений обещают дальнейшее увеличение мощности и полезность этого метода.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана studentships из Университета Эдинбурга (NSK) и Карнеги Trust (LL; Генри схемы Dryerre) и финансирования из Британского фонда сердца (PWFH, BRW, DJW; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) и Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). Авторы благодарны поддержка их работы, предоставленной BHF финансируемого Центром исследований Excellence Award в Центр сердечно-сосудистой науки.
Авторы особенно признательны за советом от профессора Масатака Sata (Университет Токусима) и д-р Игорь Chersehnev (в группе д-ра Ernane Рейс "на горе Синайской школы медицины) о создании хирургических моделей производства неоинтимальная поражения. Видео производится и продается Sata и др. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) было особенно полезным.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | コメント |
| Operating Microscope | Zeiss, Germany | N/A | OPMI Pico i |
| Anaesthetic Machine | Vet Tech, UK | N/A | |
| Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
| Bead Steriliser | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
| Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
| Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
| Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
| Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
| 15000-01 | Cohan-Vannas Spring Scissors | ||
| 11251-35 | Dumont #5/45 Forceps | ||
| 11370-31 | Moria Iris Forceps | ||
| 13008-12 | Halsted-Mosquito Haemostat | ||
| 18050-35 | Bulldog clips | ||
| Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | N/A | |
| Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | N/A | |
| Computer | Dell Inc, UK | N/A | |
| Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
| DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
| NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
| CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapour, liquid |
| Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | N/A | 0.3mg/ml |
| 1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10ml ampoule |
| EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | N/A | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | N/A | |
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
| Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 25, 0000 Units |
| Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
| Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
| Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
| Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
| Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
| Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |
参考文献
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N Engl J Med. 340, 115-126 (1999).
- Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
- McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
- Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
- Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
- Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002 (2009).
- Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu Rev Biomed Eng. 6, 209-228 (2004).
- Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906 (2011).
- Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
- Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
- Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
- Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
- Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
- Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
- Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
- Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
