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医学

생성 및 마우스의 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여

Published: May 26, 2015
doi:
10.3791/50627
, , , , , , ,
1University/ BHF Centre for Cardiovascular Science, University of Edinburgh,The Queen’s Medical Research Institute

概要

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Abstract

적절한 동물 모델에서 생성 및 혈관 병변 분석은 환부 형성의 병인 및 신규 한 치료의 작용에 관한 중요한 정보를 생성, 심장 혈관 질환에 대한 연구의 기초이다. 아테롬 발생하기 쉬운 마우스, 병변 유도 수술 방법 및식이 변형의 사용은 극적 질환 개발과 새로운 치료의 잠재적 인 기여 메커니즘에 대한 이해를 향상되었다.

고전적으로, 병변 분석은 2 차원의 조직 학적 기법을 이용하여 생체 외 수행된다. 이 문서에서는 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT)의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 이 기술은 비파괴 같이, 표준 조직 학적 및 면역 조직 화학적 분석에 부속으로서 사용될 수있다.

신생 내막 병변은 마우스 대퇴 예술의 와이어를 삽입하거나 결찰에 의해 유도 된동맥 경화 병변 동안 ERY은의 apoE 결핍 쥐에 동맥 경화 다이어트의 관리에 의해 생성되었다.

병변은 보완적인 조직 학적 및 면역 조직 화학 분석 다음 autofluorescent 방출의 OPT 영상을 이용하여 조사 하였다. 기본 혈관 벽에서 명확하게 구별 병변 OPT. 병변 크기 병소 용적과 최대 단면적의 계산을 가능하게 된 면적을 이용하여 2 차원의 섹션에서 계산되었다. OPT를 사용하여 생성 된 데이터는 기술의 정확성과 분석의 전통적인 방법에 (오히려 다른 것보다) 보완 가능성을 확인, 조직학을 사용하여 얻은 측정 값과 일치했다.

이 작품은 동맥 경화와 신생 내막 병변을 영상화에 대한 선택의 가능성을 보여줍니다. 그것은 혈관 리모델링의 일상적인 3 차원 정량화를위한 ​​신속하고 많이 필요한 생체 기술을 제공한다.

Introduction

동맥 병변의 형성은 심혈관 질환 (1)과 관련된 높은 이환율과 사망률의 핵심입니다. 병변 형성을 손상이 동맥하도록 자유롭게 염증 반응에 의한 것으로 추정된다. 재 협착 병변을 신속하게 (스텐트 시술 후, 예를 들어) 급성 기계적 손상을 다음 개발할 반면 동맥 경화성 병변은 동맥벽 만성 상처에 대한 응답으로 서서히 형성한다. 동맥 병변의 발달에 기여하는 메커니즘은 종종 중요한 유전자 조작 (1)과 조합하여, 적절한 동물 모델을 사용함으로써 상당히 밝혀져왔다.

이 생체 내 및 생체 외에서 검출이나 작은 동물의 병변 분석을 위해 개선 된 방법의 개발로 변화되지만 병변의 크기 및 조성의 분석은 고전적 (생체 외, 2 차원 조직학에 크게 의존하고있다 <SUP> 3). 동맥 병변의 조직 학적 분석은 노동 집약적이고 시간 소모적이며, 3 차원 구조의 제한된 정보를 제공한다. 예를 들면, 병변은 일반적으로 부담 병변의 단면적을 측정함으로써 평가된다 (무작위로 선택된 어느 부위에서 또는 최대 폐색 부위). 이는 전체 병변 부담의 불완전한 분석을 제공합니다. 3 차원 화상 화 기술은 이러한 문제에 대한 해결 방안을 제공하지만 놀랍게도 몇 적합한 접근법 설명되었다 항목 마운트. 이것은 자기 공명 영상 (MRI) 4 및 X 선 단층 촬영 (CT) 5 단일 광자 공 초점 현미경에 대해 너무 크지 만 너무 작은 마우스의 혈관 크기에 주로 기인 할 수있다. 생쥐의 동맥 경화 병변의 연구에 생체 자기 공명 영상의 응용 프로그램 및 마이크로 CT들은 비교적 큰 동맥에서, 제한된 해상도를 제공합니다 제안합니다. 이에 추가, 상대적으로 긴 획득 시간이 필요합니다처리량 제한 (주사 비용을 증가)를 4,6-.

(예 : 빛 간섭 단층 촬영 3,7 및 사진 음향 단층 촬영 (8)과 같은) 새로운 광학 이미징 양식의 개발은 쥐의 동맥 병변의 이미지를 개선하기위한 많은 가능성을 제공합니다. 비슷한 잠재력은 마우스 배아의 분석을 할 수 있도록 개발 된 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT)으로 표시됩니다. OPT는 직경 9 ~ 0.3-10 mm에 이르기까지 이미지를 표본으로 설계되었다. 전송 된 영상은 다색 가시광 반투명 시료의 투명도를 기록하고,이 해부학 적 구조의 식별을 위해 사용될 수있다. 내생의 특정 파장 (예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴) 및 샘플에서 외생 형광 여기에 다음과 같은 빛의 방출 영상 기록 방출. 다른 조직 성분 유형 및 autofluorescent 종의 밀도에 차이가 수 있으므로이 또한 (해부학 적 정보를 제공 할 수있다현재). 또한, 면역 또는 유전자 발현의 분포는 적절한 형광 프로브 (10)를 이용하여 결정될 수있다. 어느 촬상 모드 (전송 또는 방출)의 경우, 광은 회전 샘플 (0.9 ° 씩 통상의 이미지 (400))와 같은 반복 촬상을 허용하도록 전하 결합 소자에 집중된다. 이들은 (예 원뿔 알고리즘을 사용하여 여과 역 투영 () 또는 반복적 재구성 등) 표준 단층 재구성 방법에 의하여 대량의 계산을 위해 사용될 수있다.

이전 커크비 등. (11)에 설명 된대로이 동영상은, 동맥 경화 및 신생 내막 병변의 빠른 정량화하고 비용 효율적인 3 차원 분석을 선택 우리의 새로운 응용 프로그램을 보여줍니다. 기법은 일반적으로 사용되는 세 가지 모델 병변 크기를 정량화하기에 적합한 것으로 나타났다 : (I) 대퇴 동맥 와이어 손상; apolipoprotei에서 (ⅱ) 대퇴 동맥 결찰, 및 (iii)식이 – 유도 된 죽상 경화증N E 결핍 (의 apoE – / -) 마우스.

Protocol

마우스 대퇴 동맥의 내막 병변 1. 수술 유도 동물을 이용한 실험은 국가 및 기관의 윤리 규정에 따라 수행되어야한다. 모든 수술 적절한 무균 기술을 사용하여 수행되어야한다. 신생 내막 병변 유도 로크 외. (12)와 SATA 외. (13)에 의해 기술 된 방법의 변형을 사용하여 달성된다. 수컷 C57BL6 / J 마우스 체중 (나이 10~12주을 중량 25~30g)를 유도 한 다음 챔버 4-5 %의 이소 플루 란을 전달하여 마취시키다. 마취를 유도 한 후, 37 ° C에서 체온을 유지하기 위해 가열 된 매트에 마우스를 옮긴다. 마스크를 통해 이소 플루 란 (2-3 %)의 관리를 계속합니다. 마취의 적절한 수준 (발가락 핀치에 대한 응답의 부족) 유도되면, 부 프레 노르 핀의 투여에 의해 진통 커버를 제공 (0.1 ㎎ / ㎏ -1). 그런 다음 부정사 위치에 마우스를 올려왼쪽 뒷다리의 복부 표면을 면도 거라고. 슬와 동맥과 복부 벽 분기 사이에, 대퇴 신경에서 대퇴 동맥과 정맥을 분리하는 무딘 절개를 사용, 상단 뒷다리의 근육을 노출 절개를합니다. / 브이 lignocaine w 1 %를 사용하여 필요에 따라 상처 관개. (슬와 동맥 즉시 분기 아래) (복부 벽에 가까운)과 말초 근위 대퇴 동맥과 혈액의 흐름을 제어하는​​ 정맥 주위에 임시 합자 (6/0 Mersilk)를 놓습니다. 다음 (대퇴 동맥으로 분기에 말단 약 2-5mm에 대한) 슬와 동맥을 분리하고 원심 결찰. 슬와 동맥 아래에 두 번째, 비구 속성 합자를 놓습니다. 근위 임시 결찰에 압력을 적용하여 출혈을 방지 대퇴 동맥과 분기 바로 원위 슬와 동맥에 작은 절개 (arteriotomy)를, 확인. 직선 사전, 0.014 "가이드 와이어를 꼬셔복벽의 방향을 따라 대퇴 동맥 1.5 cm와 30 초 (도 1A)에 대해 위치에 남겨. 가이드 와이어를 제거하고 그 목적을 위해 배치 된 합자를 사용하고, 대퇴 동맥을 폐색 않도록주의하면서, arteriotomy 위의 슬와 동맥 결찰. 참고 : 결찰에 의한 부상. 관내 부상없이 신생 내막 리모델링은 대퇴 슬와 동맥 또는 (그림 1B 및 1C)을 결찰에 의해 유도 될 수있다. 이 추적이 1.1-1.5 단계를 달성하기 위해. 그러나 arteriotomy하지 않지만 (ⅰ) (단계 1.6 회피)이 슬와 동맥과 분기점에서 대퇴 동맥 또는 (ⅱ) 결찰 대퇴 동맥 바로 원위 슬와 동맥 결찰. 단계 1.8를 진행합니다. 임시 합자를 제거 불연속 외부 봉합 (5/0 Mersilk)에 상처를 닫고 EMLA 크림 (2.5 % 리도카인, 2.5 % prilocaine)을 적용한다. 동물이 다시 허용 의식 (일반적으로 5 ~ 10 분)을 얻고 그들의 새장 주위를 자유롭게 이동할 수 있도록 (약간의 파행은 영향을받는 다리에 알 수 있습니다 만,이 수술 후 첫 2-3일을 통해 해결해야한다) 객실을 보유로 돌아 가기 전에. 마우스는 수술 후 단독으로 수용 할 필요가 없습니다. 동물들은 최대 3 개월 동안 복구 할 수 있습니다. 작은 병변 7 일 와이어 손상 후 ~ 나타나기 시작하고 21-28일 ~ 후 안정적인 최대 크기에 도달 할 것입니다. 아포 지단백 E의 동맥 경화성 병변 2. 유도 – / – 마우스 12 주 남성, 육주 (집에서 자란) 이전 아포 E-널 마우스로, 서부 다이어트 (연구 다이어트, 미국 0.2 % 콜레스테롤)을 관리합니다. 동맥 경화성 병변은 종종 대동맥 궁과 주요 지점 (그림 2)의 총 점검에 볼 수 있습니다. 3.을 분석 동맥 병변 사용하여 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT) NT "> 참고 : 쥐의 대퇴 동맥과 대동맥 궁 샘플에서 병변의 OPT 이미지를 투사 광학 단층 촬영기를 이용하여 구 하였다. 10 % 중성 완충 포르말린을 이어 헤파린 (10 U / ㎖) 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용하여, 단말기 마취 하였다 (80 mg / kg 펜토 바르 비탈 나트륨) 하에서 (rongeur)로 고정하고 방혈하여 쥐를 안락사. 적절한 대퇴 동맥이나 대동맥 궁과 주요 지점 (왼쪽 경동맥, 좌측 쇄골 하 동맥, 팔 머리 트렁크)를 분리하고, 외부 근교 외막 물질을 제거. 필요할 때까지 70 % 에탄올에 저장하기 전에 10 % 포르말린의 O / N에서 후 수정. 1.5 % 저 융점 아가로 오스에 포함 동맥은 113 V 와트 만 여과지 미리 필터링. 자기 선택하는 각각의 샘플을 부착 마운트의에 맞춰 선박 축과 시아 노 아크릴 레이트 접착제로 탑재합니다. 원뿔 모양으로 초과 아가로 오스를 낸다. 적어도 12 시간 동안 100 % 메탄올 탈수. C벤질 알코올, 벤질 벤조 에이트의 혼합물에 (12 ~ 24 시간 동안)에 의해 리어 침지 용기 (1 : 2 v / v)로. 교정 단층 촬영기 클리어 샘플을 놓습니다. 1,024 X 1,024 해상도를 설정하고 관심의 전체 영역을 볼 수있는 광학 배율을 결정합니다. OPT 볼륨이 Z 축이 동일한 해상도로 재구성된다 등방성 (즉, 1024 X 1024 X 1024), 복셀의 크기 ~ 200㎛ 인. 재건 아티팩트가 될 가능성이 있기 때문에이 해상도를 통해 견적을 나타낼 수있다. 그 시야, 전송 채널에서 시야 중심에서 자체 축에 회전되도록 샘플의 위치를​​ 조정한다. GFP1 필터 방출 채널 (여기 필터 (425) 내지 밴드 패스 내지 40; 발광 필터 : 475 nm의 롱 패스)에서, 시편을 집중하고, 생성 된 화상의 동적 범위를 최대화하기 위해, 노광 시간을 조정 (과잉 포화 방지). 0.9 ° 회전 단계와, 단지 GFP1 방출 채널 스캔 용기. </ 리> 완료시 DataViewer 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집의 품질을 확인한다. 스캐너에서 표본을 제거합니다. 처리가 정상적으로 왁스 파라핀하기 전에 다음 조직 학적 분석,> 24 시간 동안 100 % 메탄올 장소 샘플을 허용합니다. 4. 이미지 재건 및 분석 여과 역 투영에 의한 단층 재 건설 NRecon 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 재건은 일괄 적으로 무인 수행 할 수 있습니다. 오정렬을 보상 및 이미지 세기 레벨을 조정하여 이미지 품질을 향상. DataViewer 소프트웨어를 사용하여 영상 재구성의 품질을 확인합니다. 분석을위한 시료의 해당 섹션을 확인합니다. 내강 차원이 기록 될 경우 혈관 사이의 일관성이 길이를 유지합니다. 수동 매 50 재 구축 단면에서 1에 해당하는 경계를 추적하여 병변의 윤곽을 정의. 컴퓨터에서 생성 된 보간이 올바른지 확인하기 위해 각 인터리브 단면을 확인합니다. 필요한 경우 수동으로 경계를 조정합니다. 단지 병변 선택되도록 그레이 레벨 임계 값을 설정하고, 측정 데이터를 반출. 각 스캔의 경우, 병변을 포함하는 관심의 수직 영역을 정의하고 미디어와 신생 내막의 경계를 추적 (예., 내부 탄성 얇은 판의 위치) 매 50 번째 스캔 라인. 소프트웨어의 인터리브 스캔 라인에 대한 내막 / 미디어 국경을 보간하고, 확인하고 필요한 경우에 맞게 수정합니다. 또한,이 세그먼트는 흰색 픽셀이 신생 내막을 나타내는 블랙 픽셀 특허 루멘을 표현하는 바이너리 이미지 세트를 생성하기 위해 수동으로 정의 강도 임계치에 입체 볼륨을 정의. 촬영 측정은 다음과 같습니다 : 총 병변 볼륨 (대상 볼륨), 내강 볼륨 (총 부피 – 객체 볼륨)과 병변의 크로스 종파 루멘 분포를연구 선박의 축 방향 길이를 따라하는 ional 지역.

Representative Results

정상 (unlesioned) 뮤린 대퇴부 동맥 예비 스캔 (N = 5) 상기 전송 촬상 유용한 이미지를 제공하지 않았다 보였다. 방출 된 신호의 기준 흡수 / 산란이 없기 때문에이 송신 imaging.However 너무 투명 (보다는 너무 불투명)되고 해제 동맥의 결과이고, 이는 발광 이미징에 유용하다. 대조적으로, 대퇴 동맥 (14 엘라스틴위한 410 nm의 여기 피크와 일치) 405-445 nm에서 여기 다음 최고의 신호, 발광 채널 강하게 autofluoresce. 이 이미지에서 복원 된 2 차원 조각은 명확하게 루멘과 외막과 루멘에서 용지를 구별. 쥐의 대퇴 동맥에서 이십팔일 와이어 – 후 (N = 6) 또는 ligation- (N = 5)에 의한 부상 신생 내막의 비후가 아닌 단층 촬영 배출 전망에 분명했다 (그림 3A)를 수확. 복원 2 dimens에서하는 ional 조각은, 동심 신생 내막 병변은 자신의 약한 방출 (그림 3B 그림 S1)에 의해 미디어에서 구별 할 수 있습니다. 동맥 경화 마우스의 OPT 방출 대동맥 궁의 전체 마운트 샘플의 이미지와 주요 지점 (N = 8) 예상되는 해부학 적 분포가 확인 된 병변 (예., 대동맥 궁, 완두 동맥과 기원의 작은 곡률 왼쪽 경동맥과 좌측 쇄골 하 동맥 (그림 4A).의 횡단면 영상이 (그림 4b는, S2 및 S3 피규어) 일반적으로 편심 병변이었고, 쉽게 미디어와 루멘 구별 있다고 지적했다. OPT 다음 조직 학적 분석을위한 처리 동맥이 성공적으로 조직 학적 (미국 트리 크롬, PICR를 사용하여 염색 섹션, OPT의 비파괴 특성을 확인osirius 적색)과 면역 조직 화학 (α-SMA, 맥-2) 기술 (도 3C와 4C). OPT를 이용하여 병변의 크기의 측정은 동일한 동맥 (11)로부터 촬영 된 이미지의 단면 조직 학적 분석을 이용하여 얻어진 측정 값과 일치하는 것으로 나타났다. 와이어 – (R 2 = 0.92) 및 결찰에 의한 (R 2 = 0.89) 신생 내막 병변과 동맥 경화성 플라크 (R = 0.85 2)을 선택하고 선형 회귀에 의해 밀접하게 연관 조직학에 의해 얻어진 병변 영역의 면적 측정 측정. OPT의 중요한 이점은 3 차원 분석을 가능하게하는 기능입니다. 이 기술로 병변의 체적 정량을 개발함으로써, 우리는에서 와이어에 병변 볼륨을 기록 할 수 있었다 (0.1100 ± 0.0091 mm 3, N = 6)와 결찰 – 부상 대퇴 동맥 (0.0200 ± 0.0089 mm 3, N = 5), 또한 동맥 경화 팔 머리 동맥에서 (0.180 ± 0.018 mm 3; N = 8). 측정 재현성 (각각 5.4 %의 변동 계수, 11.4 %, 4.8 %, N = 4)이었다 병변 모든 유형. 와이어 부상 혈관 신생 내막 병변은 이전에 의해 입은 피해의 큰 정도와 일치 결찰에 의해 생성 된 그보다 더 큰 (P <0.0001)이었다. 생성 된 데이터는 (그림 참조 S1 – S3) 병변 프로파일 (그림 5)로 표현하고 역동적 인, 질적 평가를 위해 렌더링 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 분명히 다른 부상 절차에 응답하여 환부 형성의 정도를 입증 부상 혈관 병변 형성의 치우침을 강조 하였다. 그림 1 : 쥐의 대퇴 동맥에 병변 형성을 시작하는 방법 & #.160; 슬와 동맥 arteriotomy 의하여, 대퇴 동맥에 혈관의 유도도 (A)는 역행 삽입 및 내피 손상의 제거를 스트레칭 응답하여 병변 형성을 자극한다. 혈액 흐름은 용기의 손상된 부분을 통해 다시 설정됩니다. 관내 신축성 삭박 또는 혈류 중단없는 (B) 신생 내막 증식은 대퇴 또는 대퇴 동맥 분기 바로 원위 슬와 동맥를 결찰에 의해 유도 될 수있다. (C)보다 심각한 비 denuding 부상 / 증식 반응은 대퇴 동맥의 분기점에 걸쳐 대퇴 및 오금 동맥 모두 결찰에 의해 유도 될 수있다. 이 기술은 대퇴 동맥의 말단부에 혈류를 차단하는 것이다. 그림 2 :. 12주는 대동맥 궁과 주요 지점에서 병변 증착의 특성 패턴을 개발하기위한 마우스 대동맥 아치 죽종의 특성 증착 경향이 죽상 동맥 경화증 (Apolipopotein E 결핍 생쥐)는 높은 콜레스테롤 서양 음식을 공급. 알 수 있듯이, 병변은 대동맥 궁, 팔 머리 동맥, 해부 현미경 총 검사, 표시 (화살표), 그리고 왼쪽 경동맥과 좌측 쇄골 하 동맥의 오스티. 도 3 :. 왼쪽 대퇴 동맥의 결찰 다음 병변 형성 (명확성을 높이기 위해 반전 – 어두운 영역은 강한 발광에 대응) (A) 비 형광 방출 단층 화상 내막의 비후의 식별을 허용 (적색 arrowhe광고). (B) 영역과 고유 혈관 내강이 단층 촬영 재구성에서 구별 될 수있다. (C) 조직 학적 분석 (미국 트리 크롬은) OPT를 사용하여 얻은 이미지와 명확한 유사성을 강조한다. (AC)에서 스케일 바는 200mm입니다. 커크비 등. (AC) 11 스케일 바에서 적응 200 μm의 수 있습니다. 그림 4 :. 대동맥 아치 (어두운 지역에 따라서 선명도를 개선 강한 방출 표시되도록 반전) 동맥 경화가 발생하기 쉬운 쥐의 대동맥 궁에서 죽종의 영상 (A) 죽종 (빨간색 화살촉), 쉽게 비 단층 이미지에서 알 수있다 사이트에 (그림 2 참조) 광학 현미경 하에서 검사에 의한 죽종 베어링으로​​ 예측했다. (B)이 분포의이 패턴은 단층으로 CR 확인OSS 섹션. (C) 조직 학적 (미국 트리 크롬) 염색 병변 분석에 전통적인 접근 방식과 OPT의 보완 적 성격을 여러 가지 다른 항체을 강조하여 가까운 단층 촬영 섹션과 유사하고, 면역을 보여줍니다. (A-B)에서 스케일 바는 1mm이다; (C)에서 스케일 바는 250 μm의입니다. RSA 오른쪽 쇄골 하 동맥; RCA, 오른쪽 경동맥; LCA, 왼쪽 경동맥; LSA는, 쇄골 하 동맥을 왼쪽; BCA, 팔 머리 동맥; AAO, 대동맥을 상승; DAO는 대동맥을 내림차순. 커크비 등에서 적응. (11) 그림 5 : 병변 루멘 프로파일의 분석은 동맥 손상의 다른 방법에 대한 응답으로 신생 내막 증식의 정도를 나타냅니다 다양한 광학 프로젝션 단층 촬영은 병변을 허용하고 루멘은 단면 measuremen 교차.TS는 대퇴 동맥을 따라 거리에 대해 도시합니다. 이 명확 총 결찰 (C)가 결찰의 사이트에서 완전한 폐쇄를 생산하지만 병변이 동맥을 따라 멀리 연장하지 않는 반면, 손상되지 않은 동맥 (A) 부분 결찰 (B)와 비교가, 작은, 상대적으로 분리 된 병변을 생산하는 것을 보여줍니다 . 와이어 내강 손상 (D)은 거의 완전하게 시료의 말단부를 흡장 및 동맥 주사 단면의 전체 길이를 따라 연장되는 병변을 생성한다. 커크비 등에서 적응. (11) 그림 (S1). 결찰 부상을 다음 마우스 대퇴 동맥에서 얻은 단면 이미지의 애니메이션 재건. 애니메이션 이미지의이 유형은 모두 정성 및 정량 분석에 유용합니다. 애니메이션 동맥의 원위부 섹션 기단으로부터 폐색 신생 내막의 점진적 발달을 이동함에 따라, 디스크루멘 미디어에서 ernible 쉽게 알 수있다. 곁가지를 쉽게 식별 할 수 있고, 분명 내강 흡장 및 크기가 증가함에 따라 병변 동맥의 외측 리모델링이있다. 결찰 부위에 도달하면, 용기의 완전 폐색이 발생한다. 커크비 등에서 적응. (11) .. (- 처음 나타나는 왼쪽)과 하강 (오른쪽) 대동맥 그림 (S2) 동맥 경화가 발생하기 쉬운 마우스에서 대동맥 궁의 단면 이미지의 애니메이션 재건 애니메이션은 상승의 단면으로 시작한다. 작은 병소의 대동맥 궁 방향으로 이동함에 따라 주사 대동맥에서 나타난다. 이미지는 완두 (왼쪽), 왼쪽 경동맥 (가운데)과 왼쪽 쇄골 (오른쪽) 동맥의 병변 많이 오스티을 보여 아치를 통해 이동합니다. 스캔이 지점을 따라 원심 이동하면 병변이 점차 subc에 처음으로 감소 사라lavian 동맥, 후 경동맥에 마지막으로 팔 머리 동맥. 흥미롭게도,이 용기와 분류기 위에 팔 머리 동맥 이동에 병변이 오른쪽 경동맥과 오른쪽 쇄골 하 동맥으로 나눕니다. 커크비 등에서 적응. (11) 그림 (S3). 애니메이션, 동맥 경화가 발생하기 쉬운 마우스에서 대동맥 궁의 볼륨 렌더링 된 이미지. 광학 프로젝션 단층 촬영 아포 리포 단백질 E 결핍 마우스의 대동맥 궁에서 병변의 분포를 보여,이 경우에는 3 차원 이미지를 생성 할 수있다. () 죽종은 (왼쪽 경동맥과 쇄골 하 동맥의 오스티과 대동맥 궁의 작은 곡률에, 팔 머리 동맥을 통해) 예상 사이트에 존재한다. 원 화상에 중첩 될 때 단면 베어링 (B) 세그먼트와 (적색 도시) 병변의 렌더링은 플라크의 분포를 강조한다.커크비 등에서 적응. (11)

Discussion

3 차원 분석은 교체 또는 정지 동맥 병변 형성의 연구의 대부분을 뒷받침하는 2 차원 조직 학적 기술에 추가하기위한 큰 잠재력을 가지고있다. 여기 OPT는 (아마도이​​ 기술을 이용하여 성공적으로 분석 할 수있는 가장 작은 혈관을 나타내는 뮤린 대퇴부 동맥에) 작은 쥐의 동맥에 나타낸다. 또한, 그러나, 동맥 (병변) 중소 규모 인간 혈관을 포함하는 다른 종에서 사용하기에 적합하다; 우리 그룹이 성공적으로 토끼 대동맥의 병변을 분석하는 기술을 사용하고있다 (Bezuidenhout 등;. 미 출판). OPT 전통적인 조직학 분석 비해 빠르게 증가 구조 정보를 약속하고 조직 학적 및 면역 조직 화학적 기법을 사용하여 두 샘플의 후속 분석을 방지하지 않는 장점을 갖는다.

OPT를 사용하여 제조 된 화상은 환부 형성의 위치를​​ 보여주는 해부학 상세히 준이들 지역에서 병변의 크기입니다. 이 연구에 사용 된 동맥 따라서 (아마 회전 부정 정렬, 불완전 청소, 반사 / 굴절 아가로 오스의 정점에 포커싱 문제로 인한) 유물에 의해 어느 정도 손상 기술과 이미지 품질에 대한 해상도의 한계에 아마 가까운 . 그럼에도 불구하고, 요구 사항 (즉, 용기 벽의 층)이 남아 있고, 따라서 뚜렷한 기술 각 층의 정량화에 매우 유용하다. 사실상, 이미지는 샘플에서의 선택된 부위에서 혈관의 플라크 – 함유 섹션 병변 내강 부피의 측정뿐만 아니라, 병변의 단면적과 루멘을 제공하기 위해 신속하고 재현 가능하게 정량화 될 수있다. 대형 (대동맥)과 중간 크기 (대퇴, 경동맥, 쇄골) 쥐의 동맥 – 그 일반적으로 마우스의 동맥 경화 및 neotintimal 병변 형성의 분석에 사용이 – 성공적이었다이 방법을 사용하여 분석 하였다. 사실 우리는 지금 동맥 경화와 신생 내막 병변의 크기에 약리학 적 개입과 유전자 조작의 효과를 입증하는 OPT를 사용했다. 혈관 내피 세포에서 엔도 텔린 B 수용체의 선택적 삭제하지 않았다 (15) 반면, 예를 들면, 엔도 텔린 수용체 차단이 신생 내막 병변 형성을 변경. 쉬운 마우스에서 동맥 경화증, 효소 유전자의 결실 11β-HSD1 16 galectin 3 17 죽상 경화성 병변의 크기를 줄이기 위해 도시 하였다.

병변 볼륨의 정량은 OPT의 명백한 혜택입니다. 그것은 일반적으로 조직 학적 방법으로 얻은 것보다 동맥 4 총 병변 부담의 더 많은 정보 표시를 제공합니다. 전체 병변을 분석하는 것은 선박의 개별 섹션이 분석을 위해 선택하는 경우 필연적으로 발생합니다 선택 편견과 오류를 줄일 수 있습니다. 종 병변 프로파일의 생산은 OPT의 또 다른 힘이다부상 13,16 다른 유형 (도 5)에 의해 유발 된 병변의 비교에 의해 강조. 예를 들어, 완전한 결찰 와이어 삽입 모두 femero – 오금 분기에 가까운 거의 총 폐색을 유도. 와이어 손상, 동맥 결찰에 의해 유도되는 병변 크기가 급격히 감소하고 사라지는 반면, 스캔 된 부분의 전체 길이를 따라 연장 그러나 제조 병변. 이 패턴은 혈관의 가이드 와이어의 삽입에 의한 손상의 큰 범위와 일치한다. 조직 학적 섹션을 사용하여 비슷한 결과를 생성하는 비용이, 시간과 노동 집약적.

OPT의 장점은 (우리가 일상적으로 하루에 20 척을 스캔 한)가 생산하는 이미지의 품질과 상대 속도와 단순성을 포함한다. 화질이 3 차원 화상을 생성하기위한 다른 방법으로, 우수 또는 적어도 필적 나타나는 생체, Y (예컨대 MRI와 같은 마이크로 CT)등의 OPT가 (우리의 연구 / 이미지 일반적으로 1-2sec이었다에 대한 통합 시간)과 저렴 짧은 검사 시간을 필요로한다. 시료 준비는 수일에 걸쳐 연장되지만 작은 노동 혈관 일괄 제조 될 수 있어야하고, 데이터가 하나의 세션에서 취득 할 수있다. 따라서, 스루풋이 높고 스캐너의 확장 사용을 요구하지 않는다. 중요한 것은, OPT의 비파괴 특성은 면역 검사에 대한 관심의 위치를​​ 식별하기 위해 사용될 수있는 수단; 따라서 절단의 양을 감소하고 필요한의 염색. 이것은 고해상도 초음파의 개발이 동맥 병변이 크기의 체적 정량 대체 방법을 제공하는 것을 가능하지만, 저자들은이 애플리케이션을 보여 모든 출판물 모르고.

아마도 당연히, OPT의 화질은 (물론, 단지 작은 샘플들에 수행 될 수있다) 현미경 기법에 떨어진다. 제안 된 상세 검색은 reconstructio하기데이터의 N 화질 19,20 향후 개선시킴으로써 이러한 한계를 해결할 수있다. 다른 방법론적인 관심사는 조직 처리 샘플의 특성을 변경하는 점이다. 예를 들어, 클리어링 제의 친 유성 성질은, 벤질 알코올 / 벤질 벤조 에이트 (BABB)는 물론, 탈수 및 지방 제거 단계도의 특징이며, 비록 종래 탈수 (수축을 일으킬 수 반면, 죽상 경화 병변에서 지질을 제거 가능성 파라핀 왁스에 포함 샘플 준비). BABB (예 : 글리세롤 21)은 형태 만 작은 변화가 발생 친수성 청소 에이전트와의 비교 등이 조사에 사용되었다.

특히 중요한 세포의 3 차원 배열을 추적하고 동맥 리모델링에 관련된 인자 시그널링에 관한 OPT의 발전 및 개선을위한 여러 가지 가능성이 존재한다. 이러한 인 동맥 조직 강한 형광도,해부학적인 이미지가 생성 N 장점은, 표백 (22)의 기존의 방법에 의해 급냉되지 않는 RNA 및 단백질 분포 패턴을 평가하기 위해 형광 프로브의 사용을 제한 할 수있다. 송신 촬상하여 시각화 비색 프로브의 사용은 (예를 들면 β 갈 락토시다 제)이 한계를 극복 할 수있다.

결론적으로, OPT는 쥐의 동맥의 내막에 병변의 3 차원 이미징을위한 큰 잠재력을 가지고있다. 그것은 일반적으로 노동 집약적이고 효율적으로 총 병변 볼륨을 나타내지 않는 2 차원 방법에 상당한 진보를 나타냅니다. OPT는 상대적으로 빠르고, 편리하고 비파괴입니다. 이미지 분석의 새로운 발전은 더 기술의 전력 및 유틸리티를 높일 것을 약속드립니다.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

(; 헨리 Dryerre 방식 LL)과 자금 조달 영국 심장 재단 (PWFH, BRW, DJW,이 작품은 에든버러 대학 (NSK)과 카네기 신뢰에서 studentships에 의해 지원되었다 RG를 / 05 / 008, PG / 05 / 007; PG / 08 / 068 / 25,461)와 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). 저자는 심혈관 과학 센터에 연구 우수상의 BHF-지원 센터에서 제공하는 자신의 일을 지원하기 위해 감사하고 있습니다.

저자는 신생 내막 병변 생산의 수술 모델의 설립에 교수 마사 타카 사타 (도쿠시마 대학) 및 (의학의 마운트 시나이 학교에서 박사 Ernane리스 '그룹) 박사 이고르 Chersehnev의 조언에 특히 감사하고 있습니다. 비디오 제작 및 SATA 등으로 사용할. (http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) 특히 유용했다.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number コメント
Operating Microscope Zeiss, Germany N/A OPMI Pico i
Anaesthetic Machine Vet Tech, UK N/A
Fluovac Harvard Apparatus UK 340387
Fluosorber Harvard Apparatus UK 340415
Bead Steriliser Fine Science Tools, UK 1800-45
Heated Mat Fine Sceince Tools, UK 21061-10
Balance Mettler Toledo MS1602S PB1502 or equivalent
Sutures Ethicon, UK 5/0 Mersilk
Guidewire Cook Inc, USA C-PMS-251 0.014”
Suture Silk Fine Science Tools, UK 18020-60 6/0 Mersilk
Surgical Tools Fine Science Tools, UK 14058-09 Toughcut Iris scissors
15000-01 Cohan-Vannas Spring Scissors
11251-35 Dumont #5/45 Forceps
11370-31 Moria Iris Forceps
13008-12 Halsted-Mosquito Haemostat
18050-35 Bulldog clips
Bioptonics 3001 Tomograph  Bioptonics, UK N/A
Magnetic OPT Mount Bioptonics, UK N/A
Computer Dell Inc, UK N/A
Peristaltic pump Gilson F117606 Minipuls 3
DataViewer software  Skyscan, Belgium v.1.4.4
NRecon software  Skyscan, Belgium v.1.6.8
CTan software Skyscan, Belgium v.1.12
Isoflurane Merial Animal Health Ltd, UK AP/Drugs/220/96 100% Inhalation vapour, liquid
Medical Oxygen BOC Medical, UK UN1072
Vetergesic Alstoe Animal Health Ltd, UK N/A 0.3mg/ml
1% Lignocaine Hamlen Pharmaceuticals, UK LD1010 10ml ampoule
EMLA Cream Astra Zeneca, UK N/A
Sodium Pentobarbital Ceva Animal Health Ltd, UK N/A
Western Diet Research Diets, USA D12079B 0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline Sigma UK P4417
Heparin (Mucous) Leo Laboratories, UK PL0043/003GR 25, 0000 Units
Neutral Buffered Formalin Sigma, UK HT501128 10%
Ethanol VWR BDH Prolabo, UK 20821.33 Absolute AnalaR 
Agarose Invitrogen, UK 16020050 Low melting point
Filter Paper GE Healthcare, UK 113v Whatman
Cyanoacrylate adhesive Henkel, UK 4304 Loctite
Benzyl alcohol Sigma, UK B6630
Benzyl benzoate Sigma, UK 402834
Methanol VWR BDH Prolabo, UK 20856.296 100%
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参考文献

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Kirkby, N. S., Low, L., Wu, J., Miller, E., Seckl, J. R., Walker, B. R., Webb, D. J., Hadoke, P. W. F. Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography. J. Vis. Exp. (99), e50627, doi:10.3791/50627 (2015).
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