Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.
La génération et l'analyse des lésions vasculaires dans des modèles animaux appropriés est une pierre angulaire de la recherche sur les maladies cardiovasculaires, générant d'importantes informations sur la pathogenèse de la formation de la lésion et l'action de nouvelles thérapies. L'utilisation de l'athérosclérose sujettes souris, les méthodes chirurgicales de induction de la lésion, et modification du régime alimentaire a considérablement amélioré la compréhension des mécanismes qui contribuent au développement de la maladie et le potentiel de nouveaux traitements.
Classiquement, l'analyse des lésions est effectuée ex vivo en utilisant des techniques histologiques 2 dimensions. Cet article décrit l'application de tomographie par projection optique (OPT) pour la quantification trois dimensions des lésions artérielles. Comme cette technique est non destructive, elle peut être utilisée comme traitement d'appoint à des analyses histologiques et immunohistochimiques standard.
Néointimales lésions ont été induites par insertion de fil ou une ligature de l'art fémorale de la sourisery tandis que les lésions athérosclérotiques ont été générées par l'administration d'un régime atherogene à des souris déficientes en ApoE.
Les lésions ont été examinées en utilisant l'imagerie de l'OPT de autofluorescente émission suivie par histologique complémentaire et analyse immunohistochimique. OPT lésions clairement distingués de la paroi vasculaire sous-jacente. taille de la lésion a été calculée dans les sections 2 dimensions en utilisant planimétrie, permettant le calcul du volume de la lésion et la zone de section transversale maximale. Les données générées à l'aide OPT étaient en accord avec les mesures obtenues en utilisant l'histologie, ce qui confirme l'exactitude de la technique et son potentiel en tant que complément (plutôt que de remplacement) des méthodes traditionnelles d'analyse.
Ce travail démontre le potentiel de l'OPT pour l'imagerie des lésions athérosclérotiques et néointimales. Il fournit un, si nécessaire ex vivo technique rapide pour la quantification en 3 dimensions de routine de remodelage vasculaire.
La formation de lésions artérielles est au cœur du taux élevé de morbidité et de mortalité associé aux maladies cardiovasculaires 1. la formation de la lésion est considérée comme causée par une réponse inflammatoire sans entrave aux blessures artérielle 2. Les lésions athéroscléreuses forment lentement en réponse à une blessure chronique à la paroi artérielle alors que les lésions resténotiques développer rapidement suite à une avarie mécanique aiguë (par exemple, après l'implantation du stent). Les mécanismes qui contribuent au développement de lésions artérielles ont été considérablement clarifié par l'utilisation de modèles animaux appropriés, souvent en combinaison avec des manipulations génétiques pertinents 1.
Analyse de la taille de la lésion et la composition classique a beaucoup dépendu ex vivo, l'histologie 2 dimensions (bien que cela change avec le développement de méthodes améliorées in vivo et ex vivo détection et l'analyse des lésions chez les petits animaux <sup> 3). L'analyse histologique des lésions artérielles est de main-d'œuvre, de temps et fournit des informations limitées de la structure en 3 dimensions. Par exemple, la charge de la lésion est généralement évaluée en mesurant la surface de section transversale d'une lésion (que ce soit au niveau de sites sélectionnés de façon aléatoire ou au site d'occlusion maximale). Ceci fournit une analyse incomplète de la charge globale de la lésion. Whole-mount technologie d'imagerie en 3 dimensions offre une solution possible à ce problème, mais étonnamment peu d'approches appropriées ont été décrits. Cela peut être dû principalement à la taille des artères de souris qui sont trop grands pour photon unique microscopie confocale mais trop petit pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM) 4 et X-ray tomodensitométrie (TDM) 5. Application de l'IRM et ex vivo micro CT à l'étude des lésions d'athérosclérose chez la souris suggère qu'ils offrent une résolution limitée, même à relativement grosses artères. Ajouté à cela, les temps d'acquisition relativement longs nécessaireslimiter le débit (et augmenter les coûts de numérisation) 4,6.
Développement de nouvelles modalités d'imagerie optique (comme tomographie par cohérence optique 3,7 et photo-acoustique tomographie 8) offre beaucoup de potentiel pour améliorer l'imagerie des lésions dans les artères murins. Potentiel similaire est représenté par tomographie optique de projection (OPT) qui a été développé pour permettre une analyse des embryons de souris. OPT a été conçu pour les spécimens d'image allant de ~ 0,3-10 mm de diamètre 9. Imagerie Transmission enregistre l'opacité d'un échantillon semi-translucide à la lumière visible polychromatique et peut être utilisé pour l'identification de structures anatomiques. Emission dossiers d'imagerie émission de lumière après excitation à des longueurs d'onde spécifiques de endogène (par exemple, le collagène, élastine) et fluorophores exogènes dans l'échantillon. Cela peut également fournir des informations anatomiques (depuis différents composants tissulaires peuvent différer dans le type et la densité des espèces autofluorescentesprésent). En outre, la distribution de l'immunoréactivité ou l'expression du gène peut être déterminé à l'aide de sondes fluorescentes appropriées 10. Pour que soit le mode d'imagerie (transmission ou l'émission), la lumière est focalisé sur un dispositif à couplage de charge pour permettre la capture d'image itératif de la rotation échantillon (généralement 400 images à 0,9 ° incréments). Ceux-ci peuvent être utilisés pour le calcul du volume par des procédés de reconstruction tomographique standards (tels que rétroprojection filtrée (à l'aide d'un algorithme de cône) ou reconstruction itératif).
Cette vidéo démontre notre nouvelle application de l'OPT pour l'analyse en 3 dimensions rapide, quantifiable et rentable des lésions athérosclérotiques et néointimales, comme décrit précédemment dans Kirkby et al. 11. La technique a été montré pour être adapté pour quantifier la taille des lésions en trois modèles couramment utilisés: (i) l'artère fil de blessures fémorale; (Ii) ligature de l'artère fémorale, et (iii) l'athérosclérose induite par l'alimentation en apolipoprotein E déficient (ApoE – / -) chez la souris.
Analyse en 3 dimensions a un grand potentiel pour le remplacement ou l'ajout aux techniques histologiques 2 dimensions qui sous-tendent toujours la majorité des enquêtes de la formation de lésions artérielles. Ici OPT est représenté sur les petites artères murins (souris avec artères fémorales représentant probablement les plus petits vaisseaux qui peuvent être analysés avec succès en utilisant cette technique). Il est, cependant, également adapté pour une utilisation avec des artères (lésions) et d'autres espèces, y compris les navires droits de petites et moyennes entreprises; notre groupe a utilisé avec succès la technique pour analyser les lésions de l'aorte de lapin (Bezuidenhout et al;. non publié). OPT promet une analyse plus rapide et accrue par rapport à des informations structurelles histologie classique et présente l'avantage de ne pas empêcher une analyse ultérieure de l'échantillon à la fois en utilisant des techniques histologiques et immunohistochimiques.
Les images produites à l'aide OPT ont donné des détails anatomiques, montrant les sites de formation de la lésionet la taille des lésions dans ces régions. Les artères utilisés dans ces enquêtes sont probablement proches de la limite de la résolution pour la technique et la qualité de l'image est donc altérée à un certain degré par des artefacts (probablement résultant de la rotation désalignement, compensation incomplète, de réflexion / réfraction aux sommets d'agarose et les problèmes de mise au point) . Malgré cela, les informations nécessaires (par exemple, des couches de la paroi du vaisseau) restent discernable et donc la technique est extrêmement utile pour la quantification des couches individuelles. En effet, les images ont pu être quantifiées rapide et reproductible pour fournir des mesures de la lésion et le volume luminal dans les sections plaque portant du navire, ainsi que les zones transversales de la lésion et lumière dans des sites sélectionnés dans l'échantillon. Large (aorte) et de taille moyenne (fémoral, carotide, sous-clavière) des artères de souris – celles généralement utilisées pour l'analyse de la formation de lésions d'athérosclérose chez la souris et neotintimal – ont été avec succèsanalysées en utilisant cette méthode. En effet, nous avons maintenant utilisé OPT pour démontrer l'effet des interventions pharmacologiques et la manipulation génétique de la taille d'athérosclérose et néo-intimale lésion. Par exemple, le blocage des récepteurs de l'endothéline modifié formation de lésion néo-intimale tandis que la suppression sélective du récepteur de l'endothéline B de l'endothélium vasculaire n'a pas 15. Chez les souris sujettes à l'athérosclérose, la deletion génétique des enzymes 11β-HSD-1 ou la galectine 3 16 17 ont été montrés pour réduire la taille des lésions athérosclérotiques.
Quantification du volume de la lésion est un avantage évident de l'OPT. Il donne une indication plus informatif de la charge totale de la lésion dans une artère 4 que l'on obtient généralement avec des méthodes histologiques. L'analyse de la totalité de la lésion réduit biais de sélection et d'erreurs qui vont inévitablement se produire lorsque sections distinctes d'un navire sont choisis pour l'analyse. Production de profils longitudinaux des lésions est un autre point fort de l'OPT, Soulignée par la comparaison des lésions induites par différents types de blessures 13,16 (figure 5). Par exemple, à la fois complète et la ligature d'insertion de fil induites occlusion presque totale proche de la bifurcation de femero-poplitée. blessure de fil, les lésions cependant que produits étendus sur toute la longueur de la zone de lecture, alors que les lésions induites par ligature artérielle diminuée rapidement en taille et disparaissent. Ce modèle est cohérent avec la plus grande mesure du dommage causé par l'insertion du fil guide d'angioplastie. Générer des résultats similaires en utilisant des coupes histologiques est coûteuse, longue et laborieuse.
Les avantages de l'OPT comprennent la qualité des images qu'elle produit et de sa vitesse relative et la simplicité (nous avons régulièrement balayée 20 navires par jour). La qualité d'image apparaît supérieure, ou du moins comparable, à d'autres méthodes pour générer des images en 3 dimensions ex vivo (comme l'IRM et CT micro-), yet OPT nécessite la réduction des temps de balayage (de temps d'intégration pour nos études était généralement 1-2sec / image) et est moins cher. La préparation des échantillons étend sur plusieurs jours, mais nécessite peu de travail, les navires peuvent être préparés en lots, et les données peuvent être acquis en une seule session. En conséquence, le débit est élevé et ne nécessite pas l'utilisation prolongée du scanner. Fait important, la nature non destructive de l'OPT signifie qu'il peut être utilisé pour identifier des sites d'intérêt pour l'examen immunohistochimique; réduisant ainsi la quantité de coupe et de coloration nécessaire. Il est possible que le développement de l'échographie à haute résolution fournira une méthode alternative pour la quantification volumétrique des lésions dans les artères de cette taille, mais les auteurs ne sont pas conscients de toutes les publications qui démontrent cette application.
Peut-être sans surprise, la qualité d'image dans les TPO est inférieur aux techniques microscopiques (qui peut, bien sûr, seulement être effectuées sur des échantillons plus petits). Modifications proposées à reconstruction des données peut adresser cette limitation en permettant l'amélioration future de la qualité d'image 19,20. Une autre préoccupation méthodologique est que le traitement des tissus modifie les caractéristiques de l'échantillon. Par exemple, le caractère lipophile de l'agent de compensation, l'alcool benzylique / benzoate de benzyle (BABB), est susceptible de supprimer lipides à partir de lésions athéroscléreuses, alors que la déshydratation préalable peut provoquer un rétrécissement (même si, bien sûr, de déshydratation et d'élimination des lipides étapes sont également une caractéristique de la préparation d'échantillons pour l'enrobage dans de la cire de paraffine). BABB a été utilisé dans cette étude que, par comparaison avec des agents de compensation hydrophiles (par exemple, glycerol 21) provoque que de faibles changements de morphologie.
Il existe plusieurs possibilités pour la poursuite du développement et le raffinement de l'OPT, en particulier en ce qui concerne le suivi de l'agencement en 3 dimensions des cellules clés et les facteurs impliqués dans le remodelage artériel signalisation. La forte autofluorescence de tissu artériel, qui est teln avantage dans la génération d'images anatomiques, n'a pas été désactivé par des procédés de blanchiment 22 existants et peut limiter l'utilisation de sondes fluorescentes pour évaluer les modèles de distribution de l'ARN et des protéines. L'utilisation de sondes colorimétriques (par exemple β-galactosidase) visualisés par imagerie de transmission peut surmonter cette limitation.
Pour conclure, l'OPT a un grand potentiel pour l'imagerie en 3 dimensions des lésions dans l'intima des artères murins. Il représente un progrès considérable sur les méthodes 2 dimensions qui sont généralement beaucoup de travail et ne représentent pas efficacement le volume totale de la lésion. OPT est relativement rapide, pratique et non destructive. Nouveaux développements dans l'analyse d'image promettent d'augmenter encore la puissance et l'utilité de la technique.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des bourses de l'Université d'Edimbourg (NSK) et Carnegie Trust (LL; Henry régime Dryerre) et le financement de la British Heart Foundation (PWFH, BRW, DJW; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) et le Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). Les auteurs sont reconnaissants à l'appui pour leur travail fourni par le Centre d'excellence en recherche de l'attribution BHF-financé par le Centre de sciences cardiovasculaires.
Les auteurs sont particulièrement reconnaissants pour conseils du professeur Masataka Sata (Université de Tokushima) et le Dr Igor Chersehnev (dans le groupe de Dr Ernane Reis au Mount Sinai School of Medicine) sur l'établissement de modèles de chirurgie de la production de la lésion néo-intimale. La vidéo produite et mise à disposition par Sata et al. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) a été particulièrement utile.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | コメント |
Operating Microscope | Zeiss, Germany | N/A | OPMI Pico i |
Anaesthetic Machine | Vet Tech, UK | N/A | |
Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
Bead Steriliser | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
15000-01 | Cohan-Vannas Spring Scissors | ||
11251-35 | Dumont #5/45 Forceps | ||
11370-31 | Moria Iris Forceps | ||
13008-12 | Halsted-Mosquito Haemostat | ||
18050-35 | Bulldog clips | ||
Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | N/A | |
Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | N/A | |
Computer | Dell Inc, UK | N/A | |
Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapour, liquid |
Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | N/A | 0.3mg/ml |
1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10ml ampoule |
EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | N/A | |
Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | N/A | |
Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 25, 0000 Units |
Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |