جيل والكميات 3-الأبعاد من الآفات الشرياني في الفئران عن طريق الإسقاط الضوئي المقطعي
概要
Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.
Abstract
توليد وتحليل الآفات الوعائية في النماذج الحيوانية المناسبة هو حجر الزاوية للبحث في أمراض القلب والأوعية الدموية، وتوليد معلومات هامة عن التسبب في تشكيل الآفة والعمل من علاجات جديدة. استخدام الفئران المعرضة للتصلب الشرايين، الأساليب الجراحية من آفة التعريفي، وتعديل النظام الغذائي قد تحسنت بشكل كبير فهم الآليات التي تساهم في تطور المرض واحتمال علاجات جديدة.
تقليديا، يتم إجراء تحليل للآفات خارج الجسم الحي باستخدام تقنيات النسيجية 2-الأبعاد. توضح هذه المقالة تطبيق التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية (الأراضي الفلسطينية المحتلة) إلى الكميات 3 الأبعاد للآفات الشريانية. لأن هذا الأسلوب هو غير مدمرة، يمكن استخدامه كمساعد للالتحليلات النسيجية والمناعية القياسية.
استميلت الآفات Neointimal بواسطة سلك الإدراج أو ربط الماوس الفن الفخذتم إنشاء ريها بينما آفات تصلب الشرايين عن طريق إدارة نظام غذائي تصلب الشرايين على الفئران APOE التي تعاني من نقص.
تم فحص الآفات باستخدام التصوير الأراضي الفلسطينية المحتلة من الانبعاثات autofluorescent تليها النسيجية التكميلية وتحليل المناعى. الأرض الفلسطينية المحتلة الآفات المتميزة بوضوح من جدار الأوعية الدموية الأساسي. تم حساب حجم الآفة في القسمين 2-الأبعاد باستخدام planimetry، مما يتيح حساب حجم الآفة والحد الأقصى من مساحة المقطع العرضي. وكانت البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام الأراضي الفلسطينية المحتلة بما يتفق مع القياسات التي تم الحصول عليها باستخدام الأنسجة، مما يؤكد دقة هذه التقنية وإمكاناتها كتكملة (بدلا من البديل) إلى الأساليب التقليدية للتحليل.
يوضح هذا العمل إمكانات الأراضي الفلسطينية المحتلة لتصوير تصلب الشرايين وneointimal الآفات. وهو يوفر، خارج الحي التقنية السريعة التي تشتد الحاجة إليها لتقدير 3-الأبعاد الروتيني لإعادة الأوعية الدموية.
Introduction
تشكيل الآفات الشريانية أمر أساسي لارتفاع معدلات المراضة والوفيات المرتبطة بأمراض القلب والأوعية الدموية 1. يعتبر تشكيل الآفة أن يكون ناجما عن استجابة التهابية غير المقيدة لالشرايين إصابة 2. تشكل آفات تصلب الشرايين ببطء في الاستجابة لإصابة مزمنة لجدار الشرايين في حين الآفات restenotic وضعها بعد بسرعة التلف الميكانيكي الحاد (على سبيل المثال، بعد الدعامة الزرع). وقد تم توضيح الآليات التي تسهم في تطوير الآفات الشريانية إلى حد كبير عن طريق استخدام نماذج حيوانية مناسبة، في كثير من الأحيان في تركيبة مع التلاعب الجيني ذات الصلة 1.
تحليل حجم الآفة والتكوين الكلاسيكي يعتمد بشكل كبير على المجراة سابقا، 2-الأبعاد الأنسجة (على الرغم من أن هذا بدأ يتغير مع تطور أساليب محسنة في الجسم الحي وخارج الحي كشف وتحليل الآفات في الحيوانات الصغيرة <سوب> 3). التحليل النسيجي للآفات الشريانية هي عمالة كثيفة، تستغرق وقتا طويلا، ويوفر معلومات محدودة من هيكل 3-الأبعاد. على سبيل المثال، يتم تقييم عبء الآفة عادة عن طريق قياس مساحة المقطع العرضي للآفة (إما في مواقع مختارة عشوائيا أو في موقع الأقصى انسداد). وهذا يوفر تحليلا غير مكتمل من عبء الآفة بشكل عام. كله يشن تقدم تكنولوجيا التصوير 3 الأبعاد والحلول الممكنة لهذه المشكلة ولكن تم وصفها قليلة للغاية نهج مناسبة. قد يكون هذا يرجع أساسا إلى حجم الشرايين الماوس التي تكون كبيرة جدا لاحد الفوتون المجهري متحد البؤر ولكنها صغيرة جدا للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 4 والأشعة السينية التصوير المقطعي (CT) 5. تطبيق فيفو السابقين التصوير بالرنين المغناطيسي والصغرى CT لدراسة آفات تصلب الشرايين في فئران يوحي أنها توفر قرار محدود، حتى في الشرايين الكبيرة نسبيا. يضاف إلى كل ذلك، ومرات الاستحواذ طويلة نسبيا المطلوبةلحد الإنتاجية (وزيادة تكاليف المسح الضوئي) 4،6.
تطوير طرائق التصوير الضوئي الجديدة (مثل التصوير المقطعي البصري التماسك 3،7 والصورة الصوتية التصوير المقطعي 8) تقدم الكثير من الإمكانيات لتحسين التصوير الآفات في شرايين الفئران. يظهر إمكانات مماثلة من قبل المقطعي الإسقاط الضوئية (الأراضي الفلسطينية المحتلة) التي وضعت للسماح للتحليل أجنة الفئران. وقد تم تصميم الأراضي الفلسطينية المحتلة لعينات صورة تتراوح بين ~ 0،3 حتي 10 مم وقطرها 9. التصوير نقل يسجل غموض عينة شبه شفافة للضوء المرئي متعدد الألوان، ويمكن أن تستخدم لتحديد الهياكل التشريحية. الانبعاثات سجلات التصوير انبعاث الضوء التالية الإثارة في موجات محددة من الذاتية (على سبيل المثال، الكولاجين، الإيلاستين) وfluorophores الخارجية في العينة. هذا ويمكن أيضا توفير المعلومات التشريحية (منذ مكونات الأنسجة المختلفة يمكن أن تختلف في نوع وكثافة الأنواع autofluorescentالحالي). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد توزيع مناعية أو التعبير الجيني باستخدام تحقيقات الفلورسنت المناسب (10). إما وضع التصوير (نقل أو الانبعاثات)، يركز الضوء على جهاز إلى جانب المسؤول عن السماح تكرارية التقاط الصور كما تدور عينة (عادة 400 صورة في 0.9 درجة الزيادات). هذه يمكن استخدامها لحساب حجم التداول بنسبة أساليب إعادة الإعمار تصوير الشعاعي الطبقي القياسية (مثل المصفاة الخلفية الإسقاط (باستخدام خوارزمية مخروط) أو إعادة تكراري).
يوضح هذا الفيديو تطبيق رواية لدينا من الأراضي الفلسطينية المحتلة لتحليل 3-الأبعاد السريع، وقابلة للقياس الكمي وفعالة من حيث التكلفة لآفات تصلب الشرايين وneointimal، كما هو موضح سابقا في كيركبي وآخرون. 11. وقد أظهرت هذه التقنية لتكون مناسبة لقياس حجم الآفة في ثلاثة نماذج شائعة الاستخدام: (ط) الفخذ الشريان الأسلاك الإصابات؛ (ب) الفخذ الشريان الربط، و (ج) تصلب الشرايين الناجم عن النظام الغذائي في apolipoproteiن E ناقصة (APOE – / -) الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل 3-الأبعاد لديها امكانات كبيرة لاستبدال أو إضافة إلى التقنيات النسيجية 2-الأبعاد التي لا تزال تدعم غالبية التحقيقات في تشكيل آفة الشرايين. هنا يظهر الأراضي الفلسطينية المحتلة في شرايين الفئران الصغيرة (مع الشرايين الفخذية الفئران ربما تمثل أصغر الأوعية التي يمكن تحليلها بنجاح باستخدام هذه التقنية). غير أنه، ومناسبة أيضا للاستخدام مع الشرايين (والآفات) من الأنواع الأخرى، بما في ذلك سفن الإنسان الحجم الصغيرة والمتوسطة. وقد استخدمت مجموعتنا بنجاح هذه التقنية لتحليل الآفات في أرنب الشريان الأورطي (Bezuidenhout وآخرون؛ غير منشورة). الأراضي الفلسطينية المحتلة يعد أسرع التحليل وزيادة المعلومات الهيكلية مقارنة مع الأنسجة التقليدية ولها ميزة عدم منع التحليل اللاحق للعينة باستخدام تقنيات كلا النسيجية والمناعية.
الصور المنتجة باستخدام الأراضي الفلسطينية المحتلة أعطت التفاصيل التشريحية، والتي تبين مواقع تشكيل الآفةوحجم الآفات في هذه المجالات. الشرايين المستخدمة في هذه التحقيقات هي على الأرجح قريبة من الحد من قرار للتقنية وجودة الصورة وبالتالي تضعف إلى درجة معينة من خلال الأعمال الفنية (وربما الناتجة عن دوران اختلال والمقاصة غير مكتملة، والانعكاس / الانكسار في القمم الاغاروز ومشاكل التركيز) . على الرغم من هذا، والتفاصيل المطلوبة (أي طبقات من جدار الوعاء الدموي) لا تزال ملحوظ، وبالتالي فإن أسلوب مفيد للغاية لتقدير حجم طبقات الفردية. في الواقع، يمكن أن يكون كميا الصور بسرعة وبتكاثر لتوفير قياسات الآفة وحجم اللمعية في أقسام تحمل لوحة للسفينة، وكذلك المناطق مستعرضة الآفة والتجويف في مواقع مختارة في العينة. الكبيرة (الشريان الأورطي) والمتوسطة (الفخذ، السباتي، تحت الترقوة) شرايين الفئران – تلك التي تستخدم عادة لتحليل تشكيل الآفة تصلب الشرايين وneotintimal في الفئران – كانت بنجاحتحليلها باستخدام هذا الأسلوب. في الواقع نحن لم تستخدم الآن الأراضي الفلسطينية المحتلة لإثبات تأثير التدخلات الدوائية والتلاعب الجيني على تصلب الشرايين وneointimal حجم الآفة. على سبيل المثال، endothelin مستقبلات الحصار تغيير تشكيل الآفة neointimal حين حذف انتقائي لمستقبلات endothelin B من بطانة الأوعية الدموية لم يكن 15. في تصلب الشرايين الفئران المعرضة، عرضت حذف الجينية للأنزيمات 11β-HSD1 16 أو galectin 3 17 إلى تقليص حجم آفات تصلب الشرايين.
الكمي لحجم الآفة هو فائدة واضحة من الأراضي الفلسطينية المحتلة. أنه يعطي مؤشرا أكثر إفادة من عبء الآفة الكلي في أحد الشرايين 4 من عادة يتم الحصول عليها بطرق النسيجية. تحليل الآفة كلها يقلل من التحيز في الاختيار والخطأ الذي سيحدث حتما عندما يتم اختيار أقسام منفصلة من سفينة لتحليلها. إنتاج لمحات الآفة الطولية هو مصدر قوة إضافية من الأراضي الفلسطينية المحتلة، أكد المقارنة من الآفات التي تسببها أنواع مختلفة من إصابة 13،16 (الشكل 5). على سبيل المثال، على حد سواء الربط الكامل والأسلاك الإدراج يسببها انسداد شبه كامل على مقربة من التشعب-femero المأبضية. إصابة الأسلاك، والآفات ولكن، أنتجت التي امتدت على طول القسم الممسوحة ضوئيا، في حين أن الآفات الناجمة عن عملية ربط الشرايين تتقلص بشكل سريع في حجم وتختفي. وينسجم هذا النمط مع أكبر قدر من الضرر الناجم عن إدخال سلك التوجيه الاوعية الدموية. توليد نتائج مماثلة باستخدام المقاطع النسيجية مكلفة ومستهلكة للوقت وكثيفة العمالة.
مزايا الأراضي الفلسطينية المحتلة وتشمل نوعية الصور التي تنتج والسرعة النسبية وبساطتها (لقد تم مسحها ضوئيا بشكل روتيني 20 سفينة يوميا). ويبدو أن نوعية صورة متفوقة، أو قابلة للمقارنة على الأقل، إلى أساليب أخرى لتوليد الصور 3 الابعاد خارج الجسم الحي (مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي الصغرى)، صوآخرون الأراضي الفلسطينية المحتلة تتطلب مرات المسح أقصر (الوقت التكامل لدراستنا كانت 1-2sec عادة / الصورة) وأقل تكلفة. إعداد نموذج يمتد على مدى عدة أيام ولكن يتطلب العمل القليل، والأوعية يمكن أن تكون مستعدة على دفعات، والبيانات التي يمكن الحصول عليها في جلسة واحدة. ونتيجة لذلك، سرعة عالية ولا تتطلب التوسع في استخدام الماسح الضوئي. الأهم من ذلك أن طبيعة غير مدمرة للأرض الفلسطينية المحتلة يعني أنها يمكن أن تستخدم لتحديد المواقع ذات الأهمية للفحص المناعى. وبالتالي تقليل كمية من قطع وتلطيخ المطلوبة. فمن الممكن أن تطوير عالية الدقة الموجات فوق الصوتية ستوفر طريقة بديلة للالكمي الحجمي للآفات في الشرايين بهذا الحجم، ولكن الكتاب لا يدركون أي المنشورات التي تثبت هذا التطبيق.
ربما لا يثير الدهشة، جودة الصورة في الأراضي الفلسطينية المحتلة هي أدنى من التقنيات المجهرية (التي يمكن، بطبيعة الحال، إلا أن يؤديها على عينات أصغر). التحسينات المقترحة لreconstructioن من البيانات قد تعالج هذا القيد من خلال السماح للتحسن في المستقبل من جودة الصورة 19،20. القلق المنهجي آخر هو أن معالجة الأنسجة يغير خصائص العينة. على سبيل المثال عن طبيعة المادة وكيل المقاصة، البنزيل الكحول / بنزوات البنزيل (BABB)، ومن المرجح أن إزالة الدهون من آفات تصلب الشرايين، في حين الجفاف مسبق قد يسبب انكماش (على الرغم من وبطبيعة الحال، والجفاف وإزالة الدهون الخطوات هي أيضا سمة من سمات إعداد نموذج مبنية شمع البارافين). وقد استخدم BABB في هذا التحقيق كما، بالمقارنة مع وكلاء التخليص ماء (مثل الجلسرين 21) أنه يسبب تغييرات طفيفة فقط في التشكل.
هناك عدة احتمالات لمزيد من التطوير والتحسين في الأراضي الفلسطينية المحتلة، وخاصة فيما يتعلق تتبع الترتيب 3-الأبعاد من الخلايا الرئيسية ويشير العوامل التي تدخل في إعادة الشرايين. تألق ذاتي قوي من الأنسجة في الشرايين، والذي هو من هذا القبيلن ميزة في توليد الصور التشريحية، لا تطفأ بالطرق الحالية للتبييض 22 و قد تقيد استخدام تحقيقات الفلورسنت لتقييم RNA والبروتين أنماط التوزيع. استخدام المجسات اللونية (على سبيل المثال β غالاكتوزيداز) تصور بواسطة التصوير الإرسال قد تغلب على هذا القيد.
وفي الختام، الأراضي الفلسطينية المحتلة لديها امكانات كبيرة للتصوير 3 الأبعاد للآفات في البطانية الشرايين الفئران. أنها تمثل تقدما كبيرا على أساليب 2-الأبعاد التي عادة ما تكون كثيفة العمالة ولا تمثل على نحو فعال إجمالي حجم الآفة. الأراضي الفلسطينية المحتلة هو سريع نسبيا ومريحة وغير مدمرة. تطورات جديدة في تحليل الصور وعد لزيادة قوة وفائدة هذه التقنية.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل دراسية من جامعة ادنبره (NSK) وجامعة كارنيجي الثقة (LL؛ هنري مخطط Dryerre) وبتمويل من مؤسسة القلب البريطانية (PWFH، BRW، DJW؛ RG / 05/008؛ PG / 05/007. PG / 08/068/25461) ويلكوم ترست (JRS، BRW، DJW؛ 08314 / Z / 07 / Z). المؤلفون ممتنون لدعم لعملهم التي يقدمها المركز بتمويل فتقول لجائزة التميز البحثي لمركز القلب والأوعية الدموية العلوم.
المؤلفون ممتنون بشكل خاص للحصول على المشورة من أستاذ ماساتاكا ساتا (جامعة توكوشيما) والدكتور ايغور Chersehnev (في مجموعة الدكتور Ernane ريس 'في مدرسة جبل سيناء للطب) على إنشاء نماذج الجراحية الإنتاج neointimal الآفة. إنتاج الفيديو وإتاحتها ساتا وآخرون (http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) كان مفيدا للغاية.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | コメント |
| Operating Microscope | Zeiss, Germany | N/A | OPMI Pico i |
| Anaesthetic Machine | Vet Tech, UK | N/A | |
| Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
| Bead Steriliser | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
| Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
| Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
| Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
| Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
| 15000-01 | Cohan-Vannas Spring Scissors | ||
| 11251-35 | Dumont #5/45 Forceps | ||
| 11370-31 | Moria Iris Forceps | ||
| 13008-12 | Halsted-Mosquito Haemostat | ||
| 18050-35 | Bulldog clips | ||
| Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | N/A | |
| Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | N/A | |
| Computer | Dell Inc, UK | N/A | |
| Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
| DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
| NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
| CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapour, liquid |
| Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | N/A | 0.3mg/ml |
| 1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10ml ampoule |
| EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | N/A | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | N/A | |
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
| Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 25, 0000 Units |
| Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
| Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
| Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
| Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
| Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
| Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |
参考文献
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N Engl J Med. 340, 115-126 (1999).
- Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
- McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
- Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
- Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
- Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002 (2009).
- Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu Rev Biomed Eng. 6, 209-228 (2004).
- Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906 (2011).
- Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
- Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
- Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
- Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
- Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
- Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
- Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
- Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
