בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת
概要
אנו מתארים פרוטוקול לבידוד וטיהור של נויטרופילים ממח עצם בעכבר על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות ותיוג באמצעות צבעי CellTracker נויטרופילים. זה מייצג שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור וחסכוני להשגת מספר גדול של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם או ניסויי העברה ומעקב מאמצים.
Abstract
הנויטרופילים הם תאי מפעיל קריטיים של מערכת החיסון המולדת. הם גויסו במהירות באתרים של דלקת חריפה והשפעות המגנות או פתוגניים בהתאם לסביבה הדלקתית. יחד עם זאת, על אף התפקיד החיוני של נויטרופילים בחסינות, הבנה מפורטת של הגורמים המולקולריים המתווכים השפעות מפעיל וimmunopathogenic 'נויטרופילים במחלות זיהומיות שונות ומצבים דלקתיים עדיין חסר, גם בגלל זמן מחצית החיים הקצר שלהם, את הקשיים בטיפול באלה תאים והעדר פרוטוקולי ניסוי אמינים להשגת כמות מספקת של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם וניסויים העברת מאמצת. לכן, שיטות פשוטות, מהירות, חסכונית ואמינות הן רצויות מאוד לקציר בכמות מספקת של נויטרופילים עכבר להערכת פונקציות כגון phagocytosis, הרג, ציטוקינים ייצור, degranulation וסחר בנשים. לשם כך,אנו מציגים פרוטוקול לשעתק צפיפות שיפוע מבוסס צנטריפוגה, אשר יכולה להיות מותאם בכל מעבדה לבודד מספר גדול של נויטרופילים ממח העצם של עכברים עם טוהר וכדאיות גבוהים. יתר על כן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט שמשתמש בצבעי CellTracker לתייג את נויטרופילים הבודדים, אשר לאחר מכן ניתן להעביר adoptively לעכברים נמען ולעקוב אחריו בכמה רקמות להעברה לאחר לפחות 4 שעות באמצעות cytometry זרימה. שימוש בגישה זו, תיוג ההפרש של נויטרופילים מעכברי wild-type והגן לקויים עם צבעי CellTracker שונים יכול להיות מועסק בהצלחה לבצע מחקרי Repopulation תחרותיים להערכת התפקיד הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם אל רקמות יעד in vivo .
Introduction
הנויטרופילים הם לויקוציטים הנפוץ ביותר בבני אדם. הם המרכיב התאי העיקרי של מערכת החיסון המולדת ולפעול כקו הגנה ראשון נגד הפולשים מיקרואורגניזמים. חולים עם נויטרופניה רכשה וimmunodeficiencies העיקרי המשפיעים על מספרים ו / או פונקצית נויטרופילים לפתח זיהומים, המדגישים את החשיבות של תאים אלה בשורת 1 הגנת חיידקים ופטריות פולשניות מסכנות חיים. הכרה חיסונית של פלישת פתוגנים באתר הזיהום על ידי תוצאות זיהוי ההכרה הקולטנים מאותו המקור שלהם באינדוקציה של תגובה חיסונית מולדת מתוזמרת, מה שמוביל להפרשת chemoattractants שיוצרים שיפוע chemotactic מסוגלים נויטרופילים גיוס ממחזור הדם לתוך הרקמה הדלקתית 2 . לאחר נויטרופילים להיכנס לאתר הזיהום, הם הופכים להיות פעילים, מה שמוביל לציטוקינים וchemokine ייצור, ספיגת הפתוגן, והרג דרכי חמצוני והלא חמצוניchanisms 3. חוץ מזה התפקיד שלהם המוכר היטב בחסינות מולדת, נויטרופילים יש גם הוכחו לאחרונה לתפקיד חשוב כיוזמי תגובות חיסוניות אדפטיבית יעילות 4. מצד השני, מלבד התפקידים המגן שלהם בחסינות, נויטרופילים עשויים גם לתווך פגיעה ברקמות וimmunopathology בשל צבירה ו / או הפעלה באתרים של דלקת מוגזמת, כפי שמוצגים במגוון רחב של מחלות זיהומיות ומחלות אוטואימוניות 5-7.
למרות התפקיד החיוני של נויטרופילים בתגובות חיסוניות מולדות הרכבה יעילות ופונקציות מפעיל pleiotropic בכמה מחלות זיהומיות ומצבים דלקתיים, בעיות טכניות בטיפול בתאים אלה וחוסר פרוטוקולי ניסוי אמינים עכב מחקר עם נויטרופילים בעשורים האחרונים. לכן, שימוש במבחנים לשעתק לבידוד של נויטרופילים צריכים להקל על מחקר נוסף על immunolo נויטרופילים בתיווךvivo gical הפונקציות לשעבר וin vivo. נכון להיום, מספר שיטות שתוארו לבידוד של נויטרופילים כגון צנטריפוגה צפיפות שיפוע של דם אדם ודם עכבר או מח עצם 8,9, העשרת immunomagnetic חיובית או שלילית של נויטרופילים מדם עכבר או מח עצם 10,11, וקציר של נויטרופילים מחלל הצפק של עכברים לאחר הזרקת intraperitoneal של thioglycollate או סוכנים דלקתיים אחרים 12. למרות שיכולים להיות מבודד בקלות נויטרופילים במספרים גדולים מדם אנושי, שיטה זו היא הכי מוצלח בעכברים, בשל הכמות המוגבלת של דם עכבר שמונע בידוד של נויטרופילים מספיקים ללימודים תפקודיים או ניסויי העברת מאמצת 13. בנוסף, למרות שהתשואה של thioglycollate-הושרה התאים מחלל הצפק הוא גדולים יותר בהשוואה לזה של דם עכברים, טוהר של נויטרופילים בשטיפת הצפק הדלקתי משתנה בין60-90%, ונויטרופילים המבודדים תערוכת פנוטיפ הופעל. לכן, התאים שנאספו בשיטה זו ניתן להשתמש רק לביצוע מחקרים תפקודיים של הופעל אך לא של נויטרופילים unstimulated, כחלל הצפק העכבר יש כמה נויטרופילים במצב היציב 12. במקום זאת, מח העצם הוא מאגר נוח לקצירת מספרים גדולים של שני unstimulated או הופעלו נויטרופילים 11,14, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בם ללימודי המשך, פונקציונליים, כגון phagocytosis, הרג וdegranulation, או להעברת מאמצת לעכברים נמען.
בזאת אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (~ 2 שעות), המספק תשואה גבוהה (6-12 ~ 10 × 6 נויטרופילים / עכבר נגוע, או עד 30-40 × 10 6 נויטרופילים / עכבר נגוע) של (80 טהורים -95%) נויטרופילים עם> כדאיות 95% ממח העצם. שיטה זו משתמשת Histopaque זמין באופן מסחרי, שהם נפרדים תא שיפוע צפיפותתקשורת מזון בהיקף של Ficoll וdiatrizoate נתרן, כדי להפריד בין נויטרופילים ממח העצם של עכברים. שיטה זו מניבה מספרים גדולים יותר באופן משמעותי של נויטרופילים לכל עכבר בהשוואה לדם או חלל הצפק, זה יכול לשמש כדי לאסוף נויטרופילים מעכברים הן במצב יציב או לאחר הדבקה, וזה קל יותר לשכבה בהשוואה לשיטת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות המשתמשת רציף הדרגתיים Percoll בהיקף של 55% / 65% / 75% בPercoll PBS 9. בנוסף, הזמן והמשאבים הנדרשים לאיסוף נויטרופילים טהורים הם ירדו באופן משמעותי בהשוואה לבידוד נויטרופילים באמצעות מיון תא הקרינה המופעל. כמו כן, מכיוון ששיטה זו אינה כרוכה בצעד העשרת immunomagnetic, זה יותר יעיל וחסכוני, וזה ימנע את החשיפה של תאים לעמודה ונוגדנים מגנטיים, וכך להקטין את הסבירות להפעלת נויטרופילים.
בנוסף לביצוע מחקרים תפקודיים של neutroph המבודדILS לשעבר vivo והעברת מאמצת של תאים לעכברים נמען, פרוטוקול זה גם מתאר שיטה לתיוג של נויטרופילים המבודדים באמצעות צבעי CellTracker שונים. תיוג ההפרש של נויטרופילים מעכברים של רקע גנטי שונים יכול להיות מותאם במחקרי Repopulation התחרותיים למעקב אחר נויטרופילים שהועברו ברקמות של עכברי נמען באמצעות cytometry זרימה, אשר יכול לספק תובנה מכניסטית בתפקיד הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם ליעד איברים מודלקים 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
בזאת אנו מציגים פרוטוקול אמין, פשוט, מהיר וחסכוני לבידוד של מספר גדול של נויטרופילים ממח העצם של עכברים עם טוהר גבוה וכדאיות באמצעות גישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות. כאשר פרוטוקול זה מתבצע בצורה נכונה, יכולים להיות התאוששו ~ 6-12 × 10 6 נויטרופילים מעכבר נגוע ורבים כמו …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האגף למחקר העירוני של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID), המכון הלאומי לבריאות (NIH) בארה"ב.
כל העכברים נשמרו על האגודה אמריקנית להסמכה של מתקן בעלי החיים טיפול בבעלי חיים מוכר מעבדה במכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) ושוכנו בבהתאם לנהלים המפורטים במדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה תחת חסותו של פרוטוקול שאושר על ידי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש של NIAID.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | コメント |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
参考文献
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
