Isolement, la purification et l'étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants chez les humains. Ils sont la principale composante cellulaire du système immunitaire inné et agissent comme première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs. Les patients présentant une neutropénie acquise et immunodéficiences primaires qui affectent nombre de neutrophiles et / ou la fonction développent des infections bactériennes et fongiques invasives potentiellement mortelles, en soulignant l'importance de ces cellules en défense de l'hôte ^1. Reconnaissance immunitaire des pathogènes envahissants sur le site de l'infection par leurs parentes de reconnaissance des formes récepteurs résulte en l'induction d'une orchestrée réponse immunitaire innée, ce qui conduit à une sécrétion de chemoattractants qui génèrent un gradient chimiotactique capable de recruter des neutrophiles de la circulation sanguine dans les tissus enflammés ² . Après neutrophiles entrer dans le site de l'infection, ils deviennent activées, ce qui conduit à des cytokines et chimiokines production, l'absorption des agents pathogènes, et tuant par moi oxydative et non oxydativecanismes ^3. Outre leur rôle bien connu dans l'immunité innée, neutrophiles ont également été montré récemment à jouer des rôles importants comme initiateurs de réponses immunitaires adaptatives efficaces ^4. D'autre part, en dehors de leur rôle de protection de l'immunité, les neutrophiles peuvent également arbitrer des lésions tissulaires et immunopathologie due à l'accumulation excessive et / ou l'activation des sites d'inflammation, comme le montre une variété de maladies infectieuses et auto-immunes ^5-7.

En dépit du rôle indispensable des neutrophiles dans le montage réponses immunitaires innées efficaces et leurs fonctions effectrices pléiotropiques dans plusieurs maladies infectieuses et les affections inflammatoires, les difficultés techniques avec la manipulation de ces cellules et l'absence de protocoles expérimentaux fiables a entravé la recherche avec des neutrophiles au cours des dernières décennies. Par conséquent, l'utilisation de tests reproductibles pour l'isolement des neutrophiles devrait faciliter la recherche sur médiée par les neutrophiles immunologiquesgique fonctions ex vivo et in vivo. A ce jour, plusieurs méthodes ont été décrites pour l'isolement de cellules neutrophiles telles que centrifugation en gradient de densité du sang humain et du sang de souris ou de moelle osseuse ^8,9, enrichissement immunomagnétique positif ou négatif des neutrophiles à partir de sang de la souris ou de moelle osseuse ^10,11, et la récolte des neutrophiles de la cavité péritonéale de souris après injection intrapéritonéale de thioglycollate ou d'autres agents anti-inflammatoires ^12. Bien que les neutrophiles peuvent être facilement isolés en grand nombre à partir de sang humain, cette méthode n'est pas optimale chez la souris en raison du volume limité de sang de souris qui empêche l'isolement des neutrophiles suffisantes pour des études fonctionnelles ou des expériences de transfert adoptif ^13. En outre, bien que le rendement de thioglycolate cellules de la cavité péritonéale est supérieure par rapport à celle du sang de la souris, la pureté des neutrophiles dans le lavage péritonéal inflammatoire varie entre60 à 90%, et les neutrophiles isolées présentent un phénotype activé. Ainsi, les cellules recueillies en utilisant cette méthode ne peut être utilisée pour effectuer des études fonctionnelles activé mais pas de neutrophiles non stimulés, comme la cavité péritonéale de souris a peu de neutrophiles à l'état stationnaire ^12. Au lieu de cela, la moelle osseuse est un réservoir commode pour récolter un grand nombre de neutrophiles soit non stimulés ou activés ^11,14, qui peuvent ensuite être utilisés pour des études fonctionnelles en aval tels que la phagocytose, le meurtre et la dégranulation, ou pour le transfert adoptif dans des souris receveuses.

Ici, nous décrivons un moyen simple et rapide (~ 2 h), ce qui présente un rendement élevé (~ 6-12 × 10 ⁶ neutrophiles / souris non infectées, soit jusqu'à 30-40 × 10 ⁶ neutrophiles / souris infectées) de pur (80 -95%) avec les neutrophiles> 95% la viabilité de la moelle osseuse. Cette méthode utilise Histopaque disponible dans le commerce, qui sont séparés densité cellulaire de gradientmédias de rations composées de Ficoll et diatrizoate de sodium, afin de séparer les neutrophiles de la moelle osseuse de souris. Cette méthode donne beaucoup plus grand nombre de neutrophiles par la souris par rapport au sang ou à cavité péritonéale, il peut être utilisé pour collecter des neutrophiles de souris à la fois à l'état d'équilibre ou après l'infection, et il est plus facile de couche par rapport à la méthode de centrifugation de gradient de densité qui utilise discontinue gradients de Percoll composé de 55% / 65% / 75% Percoll dans PBS ^9. En outre, le temps et les ressources nécessaires pour recueillir les neutrophiles purs sont sensiblement diminué par rapport à l'isolement des neutrophiles par tri cellulaire activé par fluorescence. Aussi, parce que cette méthode n'implique pas une étape d'enrichissement immunomagnétique, il est plus rentable, et il évite l'exposition des cellules à la colonne magnétique et des anticorps, diminuant ainsi la probabilité d'activation des neutrophiles.

En plus d'effectuer des études fonctionnelles de neutroph isoléILS ex vivo et le transfert adoptif de cellules dans des souris receveuses, ce protocole décrit également un procédé de marquage des neutrophiles isolés à l'aide de différents colorants CellTracker. Différentiel étiquetage des neutrophiles des souris de diverses origines génétiques peut être adapté à des études de repeuplement compétitifs pour le suivi des neutrophiles transférés dans les tissus des souris receveuses par cytométrie en flux, qui peuvent fournir une approche mécanistique sur le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles dans le sang en cibles organes enflammés ^6.