Трипсин Digest протокола для анализа сосудистой сети сетчатки модели мыши

Визуализация сосудистой сети сетчатки является чрезвычайно важным подходом к рассекают механизмы различных заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия. Это позволяет оценить ранние сосудистые аномалии, в том числе микроаневризмы, капиллярные дегенерации и потери перицитами ^8,9. На сегодняшний день было проведено несколько методов, разработанных для анализа сосудистой сети сетчатки. Перфузии различные красители были использованы для выделения сосудов, но все они сталкиваются с аналогичными ограничениями. Инъекции редко освещает всю сосудистую сеть сетчатки если не дано при высоком давлении, что риск разрушения и повреждения судов ^1. Иммуноокрашивание сосудистого эндотелия с флуорофором меченных G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 конъюгированные; I21413; Invitrogen; разведении 1:100) и сетчатки плоские крепления можно выделить общую архитектуру сосудов, но без детальной визуализацией капилляров, базальной мембраны и перицитах . Было отмечено,Friedenwald, что суда могут быть выделены путем окрашивания плоским крепления сетчатки с периодическими кислотно-Шиффа (PAS) или гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание ^10. Тем не менее, окрашивание неспецифической к сосудам и особо не-сосудистой ткани, а также, что делает его трудно отличить сосудов. В 1960 году Коган и Кувабара разработана методика трипсина дайджеста, который сделал его легче визуализировать сосудистую сеть сетчатки расщеплением несосудистой компонентов сетчатки ^1. С того времени, трипсин дайджест стала золотым стандартом метод в анализе сосудистой сетчатки ^2-5. Однако, важно отметить, что другие альтернативные методы, чтобы изолировать сосудистой были описаны. Использование осмотический лизис был использован, чтобы изолировать сосудистой и позволяют биохимических исследований тканей ^11,12, но процедура не был использован в качестве основного метода для анатомического исследования. Метод печати ткань былаиспользована для выделения больших сегментов микрососудов и позволяет способности к обучению электротоническим архитектуры сосудистой ^13. Теоретически, этот метод может быть также использован для изучения анатомических изменений, так как качество сосудов является высокой. Тем не менее, это только возможность изолировать сегменты всей сосудистой сети. Хотя эти методы не могут заменить трипсин дайджест, важно отметить, что они имеют различные преимущества и недостатки, и дополняют друг друга в этом отношении.

Метод трипсина дайджеста является технически сложным и трудно выполнить последовательно ^6,7. Кроме того, было отмечено, что трипсин дайджест особенно трудно на мышиной модели, в частности, если он желает сохранить общую архитектуру сосудистой сетчатки ^6,7. Проблемы включают в себя (1) по-пищеварению сетчатки, которая приводит к потере как сосудистую, а также не-сосудистую ткань, (2) при-пищеварения, требующихобширные механические рассечение который в свою очередь может привести к повреждению сосуда кровать, (3) плохое разделение не-сосудистую ткань из сосудистой приводит к неспецифическое окрашивание. Несколько рукописей выявили эти проблемы, но ни один не представил подробный и последовательный протокол их преодоления ^14,15. Эта рукопись представит шаг за шагом методологии подробно технику для выполнения трипсина дайджест на мышей и крыс с сетчатки конкретные советы по обращению с особенно трудным шагом. Схематический обзор показано на рисунке 1.