RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (<em> Apis mellifera</em>)

RNA-Interferenz (RNAi) RNA ist auf post-transkriptionale Gen-Silencing, das in einer Vielzahl von eukaryotischen Organismen auftritt. Verfahren nach RNAi durch endogene oder exogene doppelsträngige RNA (dsRNA)-Vorstufen ausgelöst. Die dsRNA aktiviert das Protein Ribonuclease Dicer bindet und spaltet die dsRNA zu kleine Fragmente (20-25 bp). Dann werden die kleinen Fragmenten der dsRNA Führung eine Erkennung und Spaltung der komplementären mRNAs durch argonaute Proteine ​​eine katalytische Komponente des RNA-induced silencing complex (RISC) ^1. Bei Säugetieren aktivieren dsRNAs länger als 30 nt, eine antivirale Reaktion (Interferon-Antwort, IFN), die unspezifische Abbau von RNA-Transkripte ² führt. Allerdings haben lange dsRNAs als wirksam erwiesen und spezifische in Insekten, da ein Mangel an diesem IFN ^3.

Lange dsRNAs haben Herunterregulation der Zielgene wurde in verschiedenen Insektenarten verwendet. Honigbienen sind eine der pionEER Insekten Organismen, in denen viele wichtige Funktionen der Gene in der Entwicklung und das Verhalten haben mit dsRNA ^4,5 offenbart worden. Mehrere dsRNA Versandmethoden haben in Honigbienen durchgeführt: dsRNA Fütterung effizient herunterreguliert Ziel Genexpression in Honigbienenlarven ^6, während dsRNA Injektion ist ein wirksamer Ansatz für die Gen-Knockdown in Honigbiene Embryonen ⁴ und erwachsenen Bienen ^7,8.

Gene Knockdown durch das Aufbringen von dsRNA Insekten ausgestellt sind vorübergehend und lokalisiert. Studien haben gezeigt, dass beide Bauch dsRNA Injektionen und Brust-dsRNA Injektionen wirksam unterdrücken Ziel Genexpression in Bauchfett Körperzellen von Insekten ^9,10. DsRNA in Bauch-und Brusthöhle und fetten Körper Zellen injiziert sind in der Lage, sich der dsRNA aus der Hämolymphe, wo die Zellen ¹⁰ gebadet werden. Allerdings können Gene in anderen Organen, wie Eierstöcke und Gehirn, nicht entweder gezieltBauch-oder Brust-Injektionen. Um Gene in Honigbiene Gehirn zielen, hat Gehirn Injektion von dsRNA auch durchgeführt worden, die effektiv beeinflusst Zielgenexpression in lokalen Hirnareale ^11. Hier haben wir nur dokumentieren Bauch dsRNA Injektion, die häufiger verwendet wird, ist bei erwachsenen Bienen.

RNAi wurde in erster Linie verwendet, um ein einzelnes Gen gezielt und ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genfunktion zu offenbaren. Allerdings ist jedes Gen nicht isoliert von den anderen, es ist in komplexen regulatorischen Netzwerke. Ein Schlüssel für einen biologischen Prozess zu verstehen ist, sezieren, wie Gene miteinander, die eine gleichzeitige Manipulationen von mehreren Genen, anstatt ein einzelnes Gen Knockdown erfordert interagieren. In Säugerzellen, haben Wissenschaftler in gleichzeitig hemmen zwei oder drei Gene mithilfe Delivery-Systeme ¹² oder multi-microRNA (miRNA) Haarnadel Designs ¹³ gelungen. Aber in Insekten, sind mehrere Gen Niederschlägen noch ungetestet. Hier presen wirt verschiedene Injektions-Strategien, die eine doppelte Gen Knockdown erreichen können. Wir haben das Ziel zwei Gene: vitellogenin (VG), die eine Vorläufer-Protein kodiert, Eigelb und Ultraspiracle (USP), die eine putative Rezeptor für Juvenilhormon (JH) codiert und als ein Transkriptionsfaktor Vermittlung antwortet JH ¹⁴ in Honigbienen dienen. Vg und JH regulieren sich gegenseitig in einer Rückkopplungsschleife ¹⁵ und sind in Honigbiene Verhaltensregulation ⁹ beteiligt. Mit dem Doppel-Gen Knockdown, entdecken wir stören sowohl Vg und JH Wege, und wie sie gemeinsam beeinflussen Honigbiene Verhalten und Physiologie und wie vg, usp und JH interagieren ^9.

Gustatorisch Wahrnehmung ist ein Verhaltens-Prädiktor für die Honigbiene Sozialverhalten ^16. In Bezug auf die Entwicklung des Verhaltens, nest Bienen mit hohen geschmacklichen Wahrnehmung behaviorally reifen schnell, und in der Regel Futter früh im Leben und es vorziehen, Pollen sammeln ^16,17. Obwohl regulatorische mechanisms zugrunde geschmacklichen Wahrnehmung sind noch unklar, Studien haben gezeigt, dass geschmackliche Wahrnehmung der internen Energiestoffwechsel ^9, Hormonausschüttung ^18,19 und biogenetische Amin Signalwege ²⁰ verbunden ist. Sowohl Vg und JH sind wichtige hormonellen Regulatoren modulierenden geschmacklichen Wahrnehmung ^7,21. Im Labor kann eine Variation der geschmacklichen Wahrnehmung in Honigbienen durch die Prüfung der Rüssel extension response (PER) zu verschiedenen Saccharoselösungen ausgewertet werden. Jede Biene durch Berühren sowohl ihre Antennen mit Wassertröpfchen durch einen aufsteigenden Konzentrationsreihe von 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% Saccharose gefolgt getestet. Eine positive Antwort wird darauf hingewiesen, wenn eine Biene voll streckt ihre Rüssel, wenn ein Tröpfchen von Wasser oder Saccharose zu jeder Antenne berührt wird. Basierend auf der Anzahl der positiven Reaktionen auf der Lösungen kann die geschmackliche Wahrnehmung Ebene der einzelnen ¹⁶ bestimmt werden. Jedoch ist die Anwendung der PER nicht auf die Messung begrenzt gustatory Wahrnehmung. Die PRO ist auch eine wirksame Methode, um den metabolischen Zustand der Bienen wie Sättigung gegen Hunger testen. Die Bienen mit mehr Antworten auf Saccharose sind hungriger im Allgemeinen (Wang und Amdam, unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus kann die PER Paradigma auch in assoziativen Lernen und Gedächtnis in Honigbienen verwendet werden. In diesem Fall Bienen ausgebildet, um die Gegenwart von Saccharose Wasser mit einem Duft zu assoziieren werden. Wenn die Bienen den Verein zu erfahren, können nur die Anwesenheit des Geruchs eine positive Antwort ohne Rüssel belohnte sie mit dem Saccharose ^22,23 evozieren. In diesem Video zeigen wir, wie Sie ausführen PER gustatory Wahrnehmung, die mit vg und usp Doppel Knockdown in einer früheren Studie ⁹ angeschlossen wurde evaluieren.