RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em> Apis mellifera</em>)

Interferência de RNA (RNAi) é baseada em ARN o silenciamento pós-transcricional que ocorre em uma ampla variedade de organismos eucarióticos. O processo de RNAi é desencadeada por RNA (dsRNA) precursores double-stranded endógenos ou exógenos. O dsRNA ativa a proteína ribonuclease Dicer que liga e corta o dsRNA de pequenos fragmentos (20-25 pb). Em seguida, os pequenos fragmentos de ARNdc de um guia de reconhecimento e de clivagem de mRNAs complementares por proteínas Argonaute, um componente catalítico do RNA induzida por complexo silenciamento (RISC) ^1. Nos mamíferos, dsRNAs mais de 30 nt, ativar uma resposta antiviral (resposta interferon, IFN), que leva à degradação inespecífica de RNA transcrições ^2. No entanto, os longos dsRNAs têm provado ser eficazes e específicos no insectos já que existe uma falta de este IFN ^3.

Longos dsRNAs têm sido utilizados para regulação negativa dos genes alvo em diferentes espécies de insectos. As abelhas são um dos pionorganismos insectos EER em que as funções de muitos genes importantes no desenvolvimento e comportamento foram revelados usando ARNdc ^4,5. Vários métodos de entrega de dsRNA foram realizados em abelhas: Alimentação dsRNA downregulates eficiente expressão do gene alvo em larvas de abelhas ^6, enquanto a injeção dsRNA é uma abordagem eficaz para knockdown do gene em embriões de mel de abelha ⁴ e abelhas adultas ^7,8.

Efeitos knockdown do gene exibidos pela aplicação de dsRNA de insetos são transitórias e localizadas. Estudos têm demonstrado que ambas as injecções de dsRNA abdominais e torácicas injecções dsRNA suprimir eficazmente a expressão do gene alvo em células de gordura corporal abdominal de insectos ^9,10. DsRNA é injetado na cavidade abdominal e torácica e células de gordura corporal são capazes de assumir o dsRNA da hemolinfa, onde as células são banhadas ^10. No entanto, os genes de outros órgãos, tais como o cérebro, ovários e não pode ser alvo de qualquerinjeções abdominal ou torácica. A fim de visar genes no cérebro da abelha do mel, a injecção de ARNcd cérebro também tem sido realizada, o que influencia de forma eficaz a expressão do gene alvo em áreas cerebrais locais ^11. Aqui, nós só documentar injeção dsRNA abdominal, que é mais comumente usado em abelhas adultas.

RNAi tem sido utilizado principalmente para atingir um único gene e tem sido uma ferramenta poderosa para revelar a função do gene. No entanto, qualquer gene não está isolada das outras, é em redes reguladoras complexas. Uma chave para a compreensão de um processo biológico é dissecar como os genes interagem uns com os outros, o que requer manipulações simultâneas de múltiplos genes, em vez de um único gene knockdown. Em linhagens de células de mamíferos, os cientistas conseguiram inibir simultaneamente dois ou três genes por meio de sistemas de entrega de ¹² ou multi-microRNA (miRNA) projeta hairpin ^13. Mas, em insetos, vários knockdowns genes ainda não foram testados. Aqui, nós present estratégias de injeção diferentes, que podem atingir um gene knockdown dupla. Nós alvo dois genes: vitelogenina (vg), que codifica um precursor da proteína da gema e ultraspiracle (USP), que codifica um receptor putativo para a hormona juvenil (HA), pode servir como um factor de transcrição de mediação de respostas a JH ¹⁴ em abelhas de mel. Vg e JH regular o outro em um ciclo de realimentação ¹⁵ e estão envolvidos em mel de abelha comportamental regra ^9. Usando o gene knockdown dupla, que perturbam tanto Vg e vias de JH, e descobrir como eles afetam conjuntamente o comportamento das abelhas de mel e fisiologia e como vg, usp e JH interagir ^9.

Percepção gustativa é um preditor comportamental para mel de abelha comportamento social ^16. Em termos de desenvolvimento comportamental, abelhas ninho com alta percepção gustativa comportamentalmente maduro rápidos, e geralmente de forragem no início da vida e preferem coletar pólen ^16,17. Embora m regulamentarecanismos subjacentes percepção gustativa ainda não estão claros, os estudos mostraram que a percepção gustativa está ligada ao metabolismo de energia interna ^9, secreção hormonal ^18,19 e biogenética amina caminhos ^20. Ambos Vg e JH são importantes reguladores hormonais modulando a percepção gustativa ^7,21. No laboratório, a uma variação da percepção gustativa em abelhas de mel pode ser avaliada testando a resposta extensão tromba (PER) para diferentes soluções de sacarose. Cada abelha é testada tocando tanto suas antenas com uma gota de água, seguido por uma série ascendente de concentração de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de sacarose. A resposta positiva é observado se a abelha estende totalmente seus tromba quando uma gota de água ou sacarose é tocado a cada antena. Com base no número de respostas positivas para as soluções, o nível de percepção gustativa de cada indivíduo pode ser determinada ^16. No entanto, a aplicação do PER não se limita a medir gpercepção ustatory. O PER é também um método eficaz para testar o estado metabólico de abelhas, tais como a saciedade vs fome. As abelhas com maiores respostas a sacarose são mais faminto em geral (Wang e Amdam, dados não publicados). Além disso, o paradigma PER também pode ser utilizado na aprendizagem e na memória associativa em abelhas de mel. Neste caso, as abelhas serão treinados para associar a presença de água de sacarose, com um odor. Quando as abelhas aprender a associação, apenas a presença do odor pode evocar uma resposta positiva tromba sem premiar os com sacarose a ^22,23. Neste vídeo, vamos mostrar como realizar PER para avaliar a percepção gustativa, que tem sido relacionada com vg e usp knockdown casal em um estudo anterior ^9.