Zebrafish의 유충 루시 페라 제 리포터 시스템과 글루코 코르티코이드 신호에 대한 화학적 스크리닝 절차

이전의 간행물 (18)에서, 우리는 GRIZLY 분석의 성능을 평가하기 위해 파일럿 (640) 화면에 FDA 승인 된 약물의 라이브러리를 스크리닝. 이 라이브러리는 따라서 우리가 분석의 민감도와 특이도를위한 질 측정을 확인 할 수 있도록, 12 선의의 GC가 포함되어 있습니다. 그림 2는 원시 데이터를 분석하고이 화면에서 촬영 정상화의 전형적인 예를 보여줍니다. 덱사메타손 컨트롤의 일반적인 결과가 아니라 데이터에 의해 주어진 시간 정보를 보여주는 그림 2a에 도시되어있다. 치료 후 약 12 시간에서 발생 생물 발광의 피크는 천천히 사다리꼴 방법을 사용하여 AUC 값의. 그림 2a는 '측정의 36 시간을 강조 다음 근사 이상 감소한다. 이 계산은 모든 우물과 각 기술에 대해 반복 실시한다. 로그 변환의 결과는도 2B <에 도시/ strong> 및 B '. 다음은 양성 대조군의 평균은 정상 QQ 플롯에 그려지는. 로그 변환은 적색 대각선으로 표시된 정규 분포 이론 값 데이터 포인트의 큰 근사치에 이르게한다. 데이터의 정상을 달성하기 위해 변환은 후속 분석의 통계적 전력을 증가시킨다. 마지막으로,도 2C 및 2C는 '판 – 투 – 플레이트의 변화에 강력한 Z 점수 정상화의 효과를 보여 다른 플레이트 (그림 2C)로 취득 서로 다른 기준 값은 그림 2C의 강력한 Z 점수의 음모에 정규화'. 강력한 Z-스코어 값 플레이트에 걸쳐 히트의 분포를 가시화함으로써 데이터의 체계적인 에러를 식별하기 위해 사용될 수있다.도 3a를 라이브러리 플레이트의 히트 맵의 일례를 도시한다 강력한 Z-점수 브로단말은 물론 위치에 색으로 구분 꾸몄다. 하나는 쉽게에서 플레이트 긍정적 인 컨트롤을 사용하여 열 (12)을 식별합니다. 긍정적 인 점수 라이브러리 화합물이 잘 F8에서 볼 수 있으며, 약한 불구하고 있으며, E2. 그림 3b는 체계적인 오류가 존재하는 한 접시를 보여줍니다. 하나는 여러 열에 대한 행과 E의 Z-점수 값을 감소와 화합물의 시리즈를 관찰합니다. 이 우물에있는 화합물의 어느 것도 재 테스트에서 양성 반응을하지 않았다. 이 감소 GRIZLY 테스트 활성 웰 라이브러리 플레이트를 분취 때 피펫 로봇 걸리는 경로를 따라 배치되어 있기 때문에,이 패턴은 자동 피펫 팅 과정 양성 화합물의 이월 나타낸다. 함께 도서관에 알려진 GC가의 존재와 강력한 Z-점수 정상화 또한 화면 (18)에 대한 특성 (ROC) 곡선을 작동하는 수신기를 산출 할 수있었습니다. 3C 그림 ESTI의 그래프를 보여줍니다다른 강력한 Z-점수 한계 값에 대한 예상 위양성률에 진정한 긍정적 인 속도를 결합. 추정 진정한 긍정적 인 환율을 주어진 강력한 Z-점수 컷오프 값에서 찾을 수 있습니다 (여기서, 라이브러리에 존재하는 알려진 글루코 코르티코이드) 참 긍정적 인 히트의 비율로 정의된다. 해당 추정 위양성률이 아닌 긍정적 인 화합물의 비율이 컷 – 오프 값에 타격을 나타냅니다. 이 곡선의 AUC는 화면과 뛰어난 분석 성능의 높은 감도 및 특이성을 나타내는, 0.95이다. AUC 곡선은 또한 다른 강력한 Z-점수에 대한 Youden 지수를 산출함으로써 히트 식별을위한 최적의 컷오프 값을 추정하는 데 사용 하였다. 우리는 가장 높은 Youden 인덱스를 갖는 것으로 1.49의 강력한 Z-점수를 확인했다. 이 컷 오프 값은 화합물의 대부분에서 안타를 분리하는 검은 선으로 그림 2C '으로 표시됩니다. 우리의 화면에서18, 우리는 도서관에 존재하는 거의 모든 알려진 GC를 식별 할 수 있었다. 만 12 선의의 GC를 세 가지가 검출되지 않았다. 이 화합물 라이브러리에 사용 된 것보다 더 높은 농도로 재 테스트에서 양성 반응 이후 melengestrol 아세테이트의 경우에, 이것은, 위음성 발견했다. 다른 두 GC가가 다시 테스트도 음성이었다. 전구 약물 프레드니손은 유충의 시스템에서 잘 대사되지 않을 수 있습니다 동안 코르티 코스 테론은 설치류의 주요 GC는 아니지만 생선이나 인간 1. 흥미롭게도 GC의 어노테이션이없는 두 약물은 하나가 다시 테스트 (스피로 노 락톤, 무기질 코르티코이드 수용체 길항제)에서 확인 할 수있는 화면에서 확인되었다. 다른 화합물, pregnenolone는 부신에서 코티솔로 변환 스테로이드 생합성의 전구체이다. 사실, pregnenolone 치료는 유충 18 코티솔 생산을 자극. 이러한 모든 결과는 높은 반환 한 확인분석의 ormance : 하나의 위음성 및 위양성 한 화합물이 기본 화면 결과들이었고, GC 신호 자극 활성을 가진 11 확인 화합물 (10)는 이미 기본 화면에서 확인되었다. 그림 1. 분석 및 심사 절차의 ​​작업 흐름의 일반 원칙.) GRIZLY 분석 기자 구조의 계획. 루시 페라 제 (노란색) 표현은 최소한의 발기인 리간드 활성화 GR 동종이 량체에 구속된다 (P 최소, 오렌지)과 네 개의 concatemerized GRE 요소 ((GRE) 4, 화이트), (GR, 파랑)에 의해 제어된다. 빨간 상자는 게놈에 구조의 통합을 용이하게 Tol2의 트랜스 포사 사이트를 나타냅니다. 분홍색 상자는 폴리 adenylation 사이트 (PA)를 나타냅니다. 이 죄수를 운반하는 형질 전환 애벌레구조체는 생물 발광 측정을 위해 불투명 한 96 웰 마이크로 플레이트에 배치됩니다. b)는 루시퍼 라제 반응의 계획. 루시 페라 제는 발광 (hν)에 이르게, oxyluciferin에 루시페린의 산화를 촉진한다. 반응은 유충에 의해 제공되는 ATP와 마그네슘 2 +가 필요합니다. 화면의 PP의 난, 피로 인산. C) 워크 플로우. 작업 주식의 희석은에서 준비 FDA는 하나의 열 (만 DMSO, 녹색)과 양성 대조군 (덱사메타손, 레드) (라이브러리 디자인)를 포함하는 하나의 열 컨트롤의 플레이트 부정을 포함, 96 웰 플레이트에서 약 라이브러리를 승인했다. GRE : 루크 유충은 96 웰 플레이트에 분포 (5-11 복제) 및 라이브러리 화합물 (약물 응용 프로그램)으로 처리됩니다. 생물 발광의 흔적 이틀 (데이터 수집)에 대한 생물 발광 리더와 함께 기록됩니다. 생물 발광의 흔적이 (AUC 계산)이 통합되어, 로그 변환하고 강력한 Z-점수가 정상화 (normalization). 표준화 된 데이터 품질 메트릭을 결정하고 히트 식별 (데이터 분석)에 사용됩니다. 선택 안타가 분석 (재시험)에서 용량 의존적 활동을 위해 다시 테스트하는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 2. 데이터 분석은 FDA가 약물 라이브러리 승인의 화면 데이터로 보여줍니다. )도 긍정적 인 제어 할 수 있습니다. ') 대표 추적은 곡선 (AUC)에서 지역은 사다리꼴 규칙과 근사. 계산에 사용되는 사다리꼴은 빨강의 다른 그늘에 표시됩니다. b)에 로그 변환하기 전에 긍정적 인 제어 우물 (y 축)의 원료 AUC 값 대 표준 일반 인구 (x 축)의 정상 QQ 플롯. B ' ) 일반 QQ 로그 변환 후 AUC 값의 플롯. 정규 분포는 로그 변환 된 데이터 요소의 선형성에 의해 지시된다. 로그 c) 플롯이 화면 전체에서 시험 화합물에 대한 원시 데이터를 변환. 블루, 선의의 글루코 코르티코이드;. 강력한 Z-점수 정상화 후 화면 데이터의 회색, 다른 화합물 C ') 플롯. 이러한 간 플레이트의 변화로 체계적인 오류는 데이터에서 제거되었습니다. 레드 라인은 긍정적 내 플레이트 컨트롤의 SEM ± 평균을 나타냅니다. 블랙 라인 : Youden – 인덱스 최적화 (그림 3)에 의해 결정되는 식별 컷 – 오프 값을 기록했다. 14, 2012의 허가를 재현 ACS. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 0439fig3.jpg "/> 그림 3. 화면 결과. 스크린 결과) 히트 맵. 라이브러리 화합물의 강력한 Z-스코어 값은 각각의 우물 위치로 꾸몄다. 열 (12)의 양성 대조군뿐만 아니라 우물 F8과 E2에있는 두 개의 긍정적 인 히트 화합물 볼 수 있습니다. 피펫 로봇 라이브러리를 준비하는 동안 긍정적 인 화합물의 이월을 보여주는 판의 B) 히트 맵. 활동의 그라데이션이 로봇에 의해 촬영 피펫 팅 경로를 따라 볼 수 있습니다. C) 수신기 화면에 대한 특성 (ROC) 곡선을 운영. 예상 사실 양성률 (왼쪽 손 y 축)과 거짓 긍정적 인 속도 (X 축)은 강력한 Z-점수 한계 값 (색상 코드, 오른쪽 Y 축)을 증가시키기위한 꾸몄다. 결과 곡선의 AUC 값은 좋은 분석 성능을 나타내는 1 부근에 자리 잡고 있습니다. ,이 2012는 14의 허가를 재현 ACS. D) 표 나타내는 화합물을 활성 (여보 쇼기본 화면 (prim.) 또는 재시험에있는 W) 또는 비활성 (파란색). 선의의 글루코 코르티코이드는 항상 (흰색) 재시험되지 않았다. 14, 2012의 허가를 다시 그려 ACS. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 일반 설정 : 단계 1.1 순서 유형 : 하나의 액체 모드 : 불어 끄다 대기음 당 분배 : 1 속도 최적화 : 예 에어 갭 시스템 : 10 μL 교통 : 0 세척 / 워시 아니 대기음 설정의 종류 값 비고 위치 B7, B10, B13, B16 기음 권. 10 μL 속도 200 μL / 초 액체 추적 60 % 기음 높이 실험기구의 기본 22.28 분배 설정의 종류 값 비고 위치 D7, D10, D13, D16 권을 분배. 10 μL 속도 200 μL / 초 액체 추적 100 μL 높이를 분배 실험기구의 기본 17.01 단계 1.2 순서 유형 : 시약 모드 : 낭비 대기음 당 분배 : 3 속도 최적화 : 예 에어 갭 시스템 : <td colspan= "2"> 15 μL 교통 : 0 세척 / 워시 아니 대기음 설정의 종류 값 비고 위치 A4 기음 권. 3 × 490 μL 에어 갭 15와 0 속도 200 μL / 초 액체 추적 400 % 기음 높이 액체 표면 분배 의 유형 랩탑 설치 값 비고 위치 D7, D10, D13, D16 권을 분배. 490 μL 에어 갭 15와 0 속도 200 μL / 초 액체 추적 100 % 높이를 분배 실험기구의 기본 17.01 표 1. Multiprobe II의 설정. 표 1 프로토콜은 4 플레이트 (각 96 웰)의 제조를 설명한다. 플레이트는 로봇 (예 : B7, B10, B13, B16)에 의해 지정된 위치에서 작업 영역에 플레이트 어댑터에 있습니다. 1 "FO : 유지 – together.within 페이지를 ="항상 "> 일반 설정 : 분석 반복 수 실행의 길이에 따라 접시의 수 제한없는 온도 조절 28 ° C 프로토콜 계산 미국 안룸 96 (CPS) 읽기 측정 시간 2.5 초 크로스 토크 보정 플레이트와 검출기 사이의 거리 0mm (CT2) 보정 계수에게 놀 0 % 내용 "> 화면에 사용되는 표 2. 구상 설정.