ゼブラフィッシュ幼虫ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたグルココルチコイドシグナル伝達のための化学スクリーニング法

以前の刊行物18には、GRIZLYアッセイの性能を評価するために、パイロット画面640 FDA承認薬のライブラリーをスクリーニングした。このライブラリは、それによって私たちは、アッセイの感度および特異性に関する品質の測定量を決定することができ、12 善意のGCが含まれていました。 図2は、この画面から採取した生データ解析及び正規化の典型的な例を示している。デキサメタゾンコントロールウェルからの典型的な結果は、データが与えられた時間情報を示す、 図2aに示されている。治療はゆっくりと、測定の次の36時間かけて減少した後、約12時間後に発生した生物発光のピーク。 図2aは、「台形法を用いて、AUCの値の近似値を強調しています。この計算は、すべてのウェルと、各技術的反復のために行われる。対数変換の結果は、 図2bに示されている</強い>とB '。ここでは、正の対照の平均は、通常のQQプロットにプロットされている。対数変換は、赤色の対角線で示され、理論値に正規分布したデータ点の大きな近似をもたらす。データの正規性を達成するための変換は、その後の分析の統計的検出力を増加させる。最後に、 図2cおよび2cは、「プレート間の変動にロバストなZ-スコア正規化の効果を示す：別のプレート（ 図2c）で得られた異なるベースライン値は、 図2cにおけるロバストZ-スコアプロットに正規化される」。 ロバストZ-スコア値は、プレートを横切るヒットの分布を可視化することによりデータの系統的エラーを識別するために使用することができる。 図3aは、ロバストZ-スコアvalのライブラリープレートのヒートマップの一例を示しているUEは、井戸の位置に色分けされたプロットされている。一つは、簡単に内プレートポジティブコントロールで列12を識別します。正スコアリングライブラリー化合物は、弱いとはいえ、E2。 図3bは系統誤差が存在するプレートを示し、十分にF8キーで見られるとしている。一つは、複数の列にわたって列AとEのZスコア値の減少に伴って一連の化合物を観察する。これらのウェル中の化合物のいずれも、再テストで陽性反応を示しませんでした。この減少GRIZLY試験活性を有するウェルライブラリープレートに小分けするときにピペッティングロボットが取る経路に沿って配置されているので、このパターンは、自動ピペッティングプロセスの間、正の化合物のキャリーオーバーの指標である。 一緒にライブラリー内の既知のGCの存在下でロバストZ-スコア正規化は、スクリーン18のための受信者動作特性（ROC）曲線を計算することができた。 図3cは、推定のプロットを示す別の堅牢なZスコアのカットオフ値の推定偽陽性率に対する真陽性率を交配。推定真陽性率は、与えられた堅牢なZスコアのカットオフ値で発見されている（ここでは、ライブラリーに存在する既知のグルココルチコイド）真陽性ヒットのパーセントとして定義される。対応する推定偽陽性率は、このカットオフ値で打撃非正の化合物の割合を示しています。この曲線のAUCは、スクリーンと優れたアッセイ性能の高い感度と特異性を示し、0.95である。 AUC曲線は、異なるロバストZ-スコアのヨーデン指標を算出することにより、ヒットの同定のための最適なカットオフ値を推定するために使用した。我々は、最高ヨーデン指標を有すると1.49のロバストZ-スコアを同定した。このカットオフ値は、化合物のバルクからヒットを分離する黒線として図2c」で示されている。 我々の画面で図18は 、我々は、ライブラリーに存在するほぼ全ての既知のGCを識別することができた。わずか12 善意の GCをの3は検出されなかった。この化合物ライブラリーで使用されるものより高い濃度での再試験において陽性反応を示したので、酢酸メレンゲストロールの場合、これは、偽陰性所見であった。他の2 GCは再検査でも陰性であった。プロドラッグプレドニゾンは幼虫システムによってうまく代謝されないかもしれないがコルチコステロンは、げっ歯類での主要なGCではなく、魚やヒト1。興味深いことに、GCのような注釈が付けられていない2つの薬は1が再テスト（スピロノラクトン、ミネラロコルチコイド受容体拮抗薬）で確認できなかったのは、画面で確認された。他の化合物、プレグネノロンは、副腎によってコルチゾールに変換され、ステロイドの生合成における前駆体である。実際に、プレグネノロンでの処理は、幼虫18内のコルチゾールの産生を刺激した。全てのこれらの結果は、高パーフォレーションを確認アッセイのormance：のみ1偽陰性と1偽陽性化合物が、一次スクリーニングの結果の中にあった、とGCシグナル刺激活性を持つ11が確認された化合物の10は、すでに一次スクリーニングで同定された。 図1アッセイおよびスクリーニング手順のワークフローの一般的な原理であって、a）GRIZLYアッセイレポーター構築物の図式。ルシフェラーゼ（イエロー）の発現は、リガンド活性化GRホモ二量体（GR、青）によって結合される最小プロモーター（P minと、オレンジ色）と4つのコンカテマーGREエレメント（（GRE）4、白）によって制御される。赤いボックスは、ゲノムへの構築物の組込みを容易にTol2のトランスポザーゼ部位を示す。ピンクのボックスには、ポリアデニル化サイト（PA）を表している。この詐欺を有するトランスジェニック幼虫構造体は、生物発光測定のために不透明な96ウェルマイクロタイタープレートに配置されている。b）はルシフェラーゼ反応のスキーム。ルシフェラーゼは、発光（hνが）につながる、オキシルシフェリンルシフェリンの酸化を触媒する。反応はまた、幼虫によって提供されるATPおよびMg 2 +を必要とする。画面のPP I、ピロリン。C）ワークフロー。作業用ストック希釈液から調製されたFDAは、1列が（DMSOのみ、緑）およびポジティブコントロール（デキサメタゾン、赤）（ライブラリ設計）を含む1列コントロール内プレートネガを含む、96ウェルプレートに薬剤ライブラリを承認した。 GRE：リュック幼虫を96ウェルプレートに分配（5-11が複製）およびライブラリー化合物（薬物適用）で処理する。生物発光トレースは二日間生物発光リーダー（データ収集）で記録されている。生物発光トレースはnormali（、（AUC計算）統合されている形質転換され、堅牢なZスコアが正規化ログzation）。正規化データは、品質メトリックを決定するために、ヒット識別（データ分析）のために使用される。選択されたヒットは、アッセイ（再試験）の用量依存的活性について再試験されています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図2。データ解析は、薬物ライブラリーをFDA承認の画面からのデータで示される。 A）よく陽性対照。A '）からの代表的なトレースは曲線下面積（AUC）は、台形公式で近似する。計算に用いた台形は、赤色の異なる色合いに示されている。b）は対数変換前の陽性対照ウェル（y軸）の生のAUC値、対、標準正規母集団（x軸）の通常のQQプロット。b 'は）通常のQQのログ変換後のAUC値をプロットした。正規分布は、対数変換されたデータ点の線形性により示される。ログc）のプロットが画面に試験した全ての化合物についての生データを変形させた。青、 善意のグルココルチコイド、。堅牢なZスコアの正規化後の画面データのグレー、他のすべての化合物C '）プロット。このようなプレート間のばらつきなどの系統誤差は、データから削除されています。赤い線は、正の内プレートのコントロールの平均±SEMを示す。黒線：ヨーデン-インデックスの最適化（ 図3）によって決定された識別カットオフ値をヒット。 14、2012 ACSから許可を得て複製。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 0439fig3.jpg "/> 図3。スクリーニング結果。スクリーン結果のa）のヒートマップ。ライブラリー化合物の強固なZスコアの値は、各ウェルの位置にプロットされる。列12における陽性対照だけでなく、井戸、F8とE2の2つの正のヒット化合物が表示されます。分注ロボットでライブラリ調製の間に正の化合物のキャリーオーバーを示すプレートのB）ヒートマップ。活動の勾配は、ロボットが撮影した分注パスに沿って表示されている。C）受信機は、画面用の特性（ROC）曲線を操作する。推定された真の陽性率（左y軸）と偽陽性率（x軸）はロバストZ-スコアカットオフ値（カラーコード化され、右側のy軸）を増加させるためにプロットされている。結果の曲線のAUC値は、良好なアッセイ性能を示し、1に近い。 14から許可を得て複製、YELLO（活性化合物を示した2012年のACS。D）表一次スクリーニング（prim.）または再試験におけるW）または非アクティブ（青）。 善意のグルココルチコイドは常に（白）再テストされませんでした。 14、2012 ACSから許可を得て再描画。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 一般的な設定： ステップ1.1 手順 タイプ： 単一の液体モード： 吹き消す吸引あたりの分注： 1 速度を最適化： はいエアギャップシステム： 10μL トランスポート： 0 同一平面/ウォッシュ いいえ 吸引物 設定のタイプ 値 備考 ポジション B7、B10、B13、B16 吸引除去巻 10μL スピード 200μL/秒液体の追跡 60％ 吸引高さ実験器具のデフォルト 22.28 ディスペンス 設定のタイプ 値 備考 体位 D7、D10、D13、D16 集を分注する。 10μL スピード 200μL/秒液体の追跡 100μL 高さを分配実験器具のデフォルト 17.01 ステップ1.2 手順 タイプ： 試薬 モード： 廃棄物吸引あたりの分注： 3 速度を最適化： はいエアギャップシステム： <td colspan= "2"> 15μL トランスポート： 0 同一平面/ウォッシュ いいえ 吸引物 設定のタイプ 値 備考 ポジション A4 吸引除去巻 3×490μL エアギャップ 15と0 スピード 200μL/秒液体の追跡 400％ 吸引高さ液面 ディスペンス Sの種類 etting 値 備考 ポジション D7、D10、D13、D16 集を分注する。 490μL エアギャップ 15と0 スピード 200μL/秒液体の追跡 100パーセント高さを分配実験器具のデフォルト 17.01 表1。マルチプローブIIの設定を行います。表1のプロトコルは、4枚（各96穴）の調製を記載する。プレートはロボット（ 例えば 、B7、B10、B13、B16）で指定された位置に作業領域にプレートアダプタに配置されています。 1 "FO：キープtogether.withinページ="常に "> 一般的な設定： 検定リピート数 ランの長さに依存 プレートの数無制限の温度制御 28℃ プロトコル 計算 米国ラム96（CPS）読み込む 測定時間 2.5秒クロストーク補正プレートと検出器の間の距離 0ミリメートルグロウ（CT2）の補正係数 0％ コンテンツ"> 画面に使用する表2。エンビジョン設定。