אנו מתארים את ההליך וניתוח נתונים של מערכת כימית הקרנה לאיתות הורמון לחץ glucocorticoid באמצעות זחלי דג הזברה: assay תגובה Glucocorticoid בvivo דג הזברה בלוציפראז הפעילות (GRIZLY). Assay ברגישות ובאופן ספציפי מזהה השפעות על איתות glucocorticoid ידי תרכובות שתידרשנה metabolization או להשפיע על ייצור glucocorticoid אנדוגני.
הורמוני לחץ glucocorticoid ונגזרים המלאכותי שלהם נמצאים בשימוש נרחב תרופות לטיפול בדלקת, אבל טיפול ארוך טווח עם גלוקוקורטיקואידים יכול להוביל לתופעות לוואי חמורים. יש צורך במערכות בדיקה כדי לחפש תרכובות רומן המשפיעות על איתות glucocorticoid in vivo או לקבוע לוואי בלתי רצוי של תרכובות במסלול איתות glucocorticoid. הקמנו assay דג הזברה מהונדס המאפשר המדידה של פעילות איתות glucocorticoid in vivo ו בזמן אמת, assay GRIZLY (Glucocorticoid תגובה בvivo דג הזברה בלוציפראז פעילות). Assay מבוסס לוציפראז מזהה השפעות על איתות glucocorticoid עם רגישות גבוהה וספציפיות, כוללים השפעות על ידי תרכובות שתידרשנה metabolization או להשפיע על ייצור glucocorticoid אנדוגני. אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לביצוע מסכי כימיים עם assay זה. אנו מתארים רכישת נתונים, נורמליזציה, וניתוח, הצבת דגש על בקרת איכות ונתונים להדמיה. Assay מספק readout פשוט, זמן נפתר, וכמותי. זה יכול להיות מופעל כפלטפורמה עצמאית, אבל גם לשלב בקלות לתוך זרימות עבודה הקרנת תפוקה גבוהה. יתר על כן הוא מאפשר ליישומים רבים מעבר להקרנה כימית, כגון ניטור סביבתי של משבשים האנדוקרינית או מחקר לחץ.
גלוקוקורטיקואידים (GCS) הם הורמוני סטרואידים המיוצרים על ידי בלוטת יותרת הכליה אשר ממלאות תפקידים חשובים בתגובת הלחץ ובויסות חילוף החומרים 1. GCS לאגד קולטני glucocorticoid cytoplasmic (GRS) של superfamily רצפטור הגרעיני אשר, על כריכה, translocate לתוך הגרעין 2. כאן, הם יכולים למשל לדכא שעתוק על ידי הפרעה עם גורמים אחרים שעתוק (transrepression) או להפעיל את שעתוק הגנים באמצעות אלמנטי glucocorticoid תגובה (Gres, transactivation). בשל התכונות אנטי דלקתית שלהם, GCS הטבעי והמלאכותי נמצא בשימוש נרחב תרופות לטיפול במספר המחלות, כגון אסטמה או דלקת פרקים 3. עם זאת, ובמיוחד שימוש לטווח ארוך של GCS יכול להוביל לתופעות לוואי קשים, כוללים סוכרת וגלאוקומה 4. לכן, תרכובות רומן מיקוד GC איתות עם יעילות טיפול שעלול להיות מועילה יותר וסבילות הן מאוד מבוקשים ומאחוראה. חשוב מכך, השפעות יגנד נצפו בתאים בתרבית יכולות להיות שונות מאלו שראו בvivo 5. תופעות כאלה עלולות תוצאות הטיה שהושגו עם תרבית תאים קונבנציונלית מבחני מיון תרופות מבוססות. הקרנת in vivo כימית כמו מופעל על ידי מודל דג הזברה הגיעה לאחרונה אל מוקד, שכן היא מאפשרת הקביעה של השפעות לא ניתן לגילוי בתא התרבות 6,7.
יכולים גם להיות מושפעים מסלולי איתות הורמונלי על ידי מזהמים סביבתיים. כימיקלים שנקרא האנדוקרינית לשבש (EDCs) להשפיע על תהליכי הורמון מוסדר שונים 8. לפיכך, רבייה והתמיינות מינית של אורגניזמים החיים במים יכולים להיות מווסתת על ידי חומרים עם פעילות דמוית אסטרוגן. לאחרונה, חששות הועלו, כי הפרעות מטבוליות עשויות להיות קשורות לEDCs בסביבה 9. מסלול אחד הממוקד על ידי "שיבוש מטבולים" כזה הוא מסלול glucocorticoid, שגם היה מעורב בקסנוהשפעות biotics על התפתחות ותפקוד מערכת החיסון 10,11. עם זאת, בהשוואה לכמות הגדולה של מידע נגיש בתרכובות מפריעות לפעולה הורמון סטרואידי מין, יחסית מעט מאוד ידוע על השפעות הפרעה אנדוקרינית בתיווך באמצעות GR. לכן, יש צורך בכלים המאפשרים ניטור השפעות של מזהמים על איתות GC in vivo.
דג הזברה כבר זמן רב מודל פופולרי בביולוגיה התפתחותית ולאחרונה גם משך חוקרים מתחומים אחרים, כולל אנדוקרינולוגיה 12. בהשוואה לבעלי חוליות אחרות, מערכת איתות GC של דג הזברה היא דומה יותר לזה של יונקים, שכן הגנום דג הזברה מכיל רק גן אחד GR בניגוד לקולטנים המשוכפלים בהרבה מיני דגים אחרים 13-15. בנוסף, הציר ההיפותלמוס, יותרת המוח, יותרת הכליה הוא כבר פונקציונלי בזחלי דג הזברה בן 5 ימים, אשר להגביר את ייצור GC אנדוגני בתגובה ללחצים 14,16-18.
יש לנו לאחרונה שנוצרו קו מהונדס דג הזברה, GRE: לוק, המאפשר הניטור של פעילות איתות GC in vivo ו בזמן אמת 18. שורת נושא מבנה גן כתב לוציפראז תחת שליטה של אמרגן מינימאלי TATA תיבה וארבעה GRES concatemerized (איור 1 א). פליטת אור מושרה GC ניתן למדוד מGRE אחת: זחלי לוק ב96 צלחות microtiter גם in vivo על פני תקופות זמן ממושכות. assay זה GRIZLY (עבור "תגובה בvivo דג הזברה בלוציפראז פעילות Glucocorticoid") ניתן להשתמש במספר תחומי מחקר שונים, כגון מחקר מתח, ניטור סביבתי, ומסכי תרופתיים 18. היינו מסוגל לזהות את עליית אנדוגני בקורטיזול לאחר לחץ האוסמוטי מזחלים בודדים ויכולים לעקוב אחר ההתבגרות של התגובה בזמן פיתוח. יתר על כן, אנחנו יכולים לעקוב אחר ההשפעות על איתות GC של organotinים שדורשים metabolization ידי הזחל. חשוב מכך, הקו היה מסוגל לזהות את ההשפעות הללו בריכוזים רלוונטיים לסביבה. לבסוף, במסך טייס assay ברגישות ובאופן ספציפי זוהה תרכובות עם פעילות GC מספרייה כימית, כולל מתחם אחד שמגורה ייצור קורטיזול אנדוגני בזחלים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למסכים כימיים באמצעות assay GRIZLY.
אנו מציגים כאן את העבודה וניתוח נתונים עבור מסך כימי מדידת פעילות GC in vivo באמצעות assay GRIZLY 18. יש assay מאפייני בקרת איכות ומדדי ביצוע שניתנים להשוואה עם מסכי סלולריים מבוסס קונבנציונליים, יתרון חשוב עבור השימוש בו בהגדרות תפוקה גבוהה. בנוסף לכך, עם זאת, vivo assay במזהה גם תרכובות שאינן נגישים במבחנת מסכים. זה בא לידי ביטוי על ידי הנוכחות של pregnenolone prohormone בין הלהיטים. לפיכך, assay GRIZLY מרחיב את היקף מסכי שמטרת פעילות איתות GC.
החשיבות של זיהוי של in vivo אפקטים עם assay שלנו באה לידי ביטוי גם בתוצאות שהשגנו עם DBT מזהמי organotin וTBT 18. DBT, אבל לא TBT, הוכח לעכב איתות GC בתרבית תאים של יונקים, ואנו נצפו באותו בתרביות תאי דג הזברה לבטאing GRE: כתב לוק. חשוב לציין עם זאת, בassay GRIZLY, TBT הראה פעילות מעכבת על מסלול GC, כפי שהוא יכול להיות מומר לDBT על ידי חילוף החומרים הזחל. עיכוב זה נצפה כבר בריכוזים רלוונטיים לסביבה של TBT. תוצאות אלה נוספות להמחיש את הפוטנציאל של assay GRIZLY באיתור תופעות מורכבות, המבוססות על שיחה צולבת וחילוף חומרי שינויים בין אורגן של התרכובות בחי. הם גם מדגישים את פוטנציאל היישום של assay GRIZLY לניטור סביבתי. לפיכך, ניתן ללמוד אפקטי משבש אנדוקריני ברמה של איתות קולט, שבו המשבש מפריע לפעילות איתות GC הנגרמת על ידי אגוניסט GR כגון dexamethasone. אפשרות נוספת היא ללמוד השפעות מתחם על סינתזת GC-מגורה pregnenolone. איכות התפוקה הגבוהה של assay צריכה להתיר את ההקרנה המהירה של ספריות מדגם סביבתי.
השימוש בלוציפראז כמו arגן eporter מאפשר טווח דינמי גבוה של זיהוי של איתות פעילות 23. ואכן, הרגישות של assay מאפשרת לזהות ייצור GC-Induced מתח האוסמוטי מזחלים בודדים 18. הרזולוציה הגבוהה הזמנית שהושגה עם הכתב בלוציפראז מאפשרת לנו לעקוב אחר פעילות איתות לאורך זמן, מה שהופך אותו ניתן לנתח גם קינטיקה של נתונים.
חסרון פוטנציאלי עבור יישומים מסוימים הוא התאמתו המוגבלת לניטור המרחבי של מערכת הכתב הזה. מערכות כתב ניאון עשויות להיות מתאימות יותר עבור מבחני הדורשים ניטור של אזורים מסוימים של הזחלים. עם זאת, מבחני כאלה עלולים לסבול מרגישויות נמוכות יותר בשל השפעות רקע הנגרמות על ידי אור העירור, שגם מציב מגבלות על זיהוי של תרכובות ניאון. בנוסף, הם עשויים לספק פחות רזולוציה הקינטית בגלל היציבות בדרך כלל גבוהה יותר של חלבוני ניאון 23.יתר על כן, הם מציגים את האתגרים במונחים של ציוד הדמיה, ניתוח נתונים ואחסון נתונים שעשויים להגביל את השימוש בם למעבדות מחקר קטנות יותר.
ההגדרה של assay GRIZLY כassay המבוסס צלחת microtiter מאפשרת אינטגרציה קלה לתוך זרימות עבודה הקרנה טיפוסיות. Assay הוא ישים בקלות גם במעבדות מחקר קטנות יותר כתוצאה מהטיפול שלה פשוט וניתוח נתונים. במקביל, היא מאפשרת למידה ניכרת של אוטומציה, למשל אוטומטית יישום תרופה על ידי pipetting רובוטים או הפצה אוטומטית של עוברים על ידי מכשירי עובר מיון 24,25. את ההודעה הפשוטה אינו דורש מיקרוסקופים הקרנה אוטומטיים או תוכנת ניתוח תמונה מתוחכמת, ועם זאת מספקת מערך עשיר של נתונים על היבטים של זמן וכמותי של מסלול האיתות למד.
לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לassay הקרנה כימית זול יחסית, חזק וקל לידית לGCאיתות פעילות in vivo ובזמן אמת. Assay מאפשר קביעת in vivo השפעות של תרכובות בGC איתות לא ניתן לגילוי בתרבית תאים מבוסס מבחני. למשל הקביעה של השפעות גנטיות על איתות glucocorticoid, ניטור סביבתי של השפעות משבש אנדוקריני על סינתזת glucocorticoid ואיתות פעילות, וההקרנה של תרכובות להשפעות לא רצויות על איתות GC או לרומן במאפנני vivo מכך, בין יישומים רבים עבור assay הם מסלול איתות חשוב.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ס Burkhart, ג הופמן וסימון Gräßle לקבלת סיוע טכני מעולה והם אסירי תודה למ 'Ferg לעזרה בניתוח נתונים. אנו מודים גם ס Rastegar להערות ביקורתיות על כתב היד. אנו מכירים במימון על ידי Studienstiftung des deutschen Volkes (לMW), DFG (DI913/4-1) וBioInterfaces תכנית הלמהולץ בKIT.
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Buffer composition + reagents | |||
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Carl Roth GmbH & Co KG | A994.2 | |
FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
E3 | N/A | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 |
Instruments | |||
Multiprobe II | PerkinElmer | 8 channel, equipped with disposable tip adaptor | |
Liquidator 96 | Steinbrenner Laborsysteme | hand-operated 96-channel pipette | |
EnVision XCite Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector | |
Plasticware + consumables | |||
96-Well Storage Plate | ABgene | AB-0765 | round well, 0.8 ml |
Cover films, | ratiolab | 6018412 | self adhesive, DMSO resistent |
Pipette tips | Steinbrenner Laborsysteme | LRF-200L | for liquidator 96, 200 μl, low retention |
TopSeal-A | PerkinElmer | 6005185 | |
OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005299 | white opaque 96-well microplate |
Barcode Labels | PerkinElmer | 1608182 | |
filtered polypropylene IsoTip pipette tips | Corning | S058.4809 | |
Animals | |||
GRE:Luc fish | N/A | ZDB-TGCONSTRCT-120920-1 | available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe |