Bir<em> Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları> Model Sistemi
概要
Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler tarif<em> C. elegans</em>. Biz insan Aβ ifade solucanlar oluşturmak için nasıl göstermek<sub> 42</sub> Nöronlarda ve nasıl davranış testleri kendi işlevini test etmek için. Biz daha fazla farmakolojik test için kullanılabilir birincil nöronal kültürlerin edinme göstermektedir.
Abstract
Amylopathy zamanla dokularda amiloid beta anormal sentezi ve birikimi (Aβ) tanımlayan bir terimdir. Aβ Alzheimer hastalığı (AH) bir özelliğidir ve Lewy cismi demans, dahil vücut miyozit ve serebral amiloid anjiyopati 1-4 bulunur. Amylopathies giderek zamanla gelişir. Bu nedenle kısa ömürlü basit organizmaların bu koşulların moleküler yönlerini aydınlatmak için yardımcı olabilir. Burada, solucan Caenorhabditis elegans kullanarak Aβ-aracılı nörodejenerasyon incelemek için deneysel protokolleri tarif. Böylece, yetişkin çift cinsiyetli en sinsisyal gonadlar içine kodlayan DNA insan Aβ 42 enjekte edilerek transgenik solucanlar inşa. Transformant çizgiler Mutasyon-kaynaklı entegrasyonu ile stabilize edilir. Nematodlar yumurtalarını toplama ve ekim ile senkronize yaş vardır. Aβ 42 eksprese eden nöronların fonksiyonu (elverişli davranış tahlillerinde test edilir kemotaksi deneyis). Embriyolardan elde edilen primer nöronal kültürler davranışsal verileri tamamlamak için ve anti-apoptotik bileşiklerin nöro-koruyucu etkisini test etmek için kullanılır.
Introduction
Beta amiloid (Aβ) β ve γ secretases 1 ile amiloid ön-madde proteininin (APP) sıralı bölünme sonra oluşan 36-43 amino asitlik bir peptiddir. Γ sekretaz Aβ peptidin C-terminal ucu işler ve değişken uzunlukta 5 sorumludur. Aβ en yaygın formları Aβ 40 ve Aβ 42, daha yaygın olarak, AD 5 gibi patolojik durumları ile ilişkili olan ikinci bulunmaktadır. Yüksek konsantrasyonlarda Aβ formu β-yaprak azından amiloid fibriller 6 oluşturmak için agrega. Fibriller yatakları nöronları çevreleyen senil plaklar ana bileşenidir. Plaklar ve yayılabilir, olmayan plak Aβ oligomerler, hem Aβ altında yatan patojenik formları oluşturacağı düşünülmektedir.
Nöronal amylopathies Laboratuvar çalışma süresi ile bu bu koşullar ilerleme gerçeği ile karmaşık. Bu nedenle, importanfareler-kısa ömrü için model-tamamlayıcı genetik uysal hayvan geliştirmek için t. Bu modeller amylopathies-genellikle hücresel ve moleküler-ve basitliği sayesinde, sorunun özünü yakalamak için yardımcı belirli yönlerini aydınlatmak için kullanılabilir. Solucan Caenorhabditis elegans düşüyor bu kategorisidir. Bu kısa bir ömrü vardır, ~ 20 gün ve gen ifadesi, protein kaçakçılığı, nöronal bağlantı, sinaptogenez, hücre sinyalizasyon ve ölüm düzenlenmesi de dahil olmak üzere ek temel hücresel süreçleri memeli 7 benzer. Solucanın benzersiz özellikleri güçlü genetik ve bağımsız vasküler hasar nöronal hasarı incelemek için sağlayan bir damar sistemi, eksikliği içerir. Öte yandan, bir beyin eksikliği C kullanımını sınırlamaktadır nörodejenerasyon birçok açıdan eğitim için elegans. Buna ek olarak, lezyonların anatomik dağılımlarının üreme ve kimlik bu organizmada gerçekleştirilemez. Diğer sınırıations gen ekspresyon profilleri ve karmaşık davranış ve hafıza fonksiyon bozukluğu hem de farklılıkları değerlendirmek için zorluk içerir. Burada C oluşturmak için yöntemler tarif amylopathies bir elegans modelleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada C. kullanarak amylopathies hücresel ve moleküler yönlerini incelemek için, kombine yaklaşım tarif elegans. Bu yaklaşımın avantajları şunlardır:. 1) düşük maliyetli C.elegans oda sıcaklığında, bakterilerle numaralı seribaşı normal bir Petri kabı korunur. 2) Güçlü genetik. Transgenik hayvanlar birkaç ay içinde elde edilen promotör sekansları ve geniş bir dizi spesifik nöronlarda istenen genin ekspresyonunu yürütmek için kullanılabilir edilebilir. 3) Bas…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | コメント |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
参考文献
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
- Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
- Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
- Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
- Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
- DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
- Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
- Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
- Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
- Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
- Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
