概要

A<em> Caenorhabditis elegans</em> Système modèle pour l'étude de Amylopathy

Published: May 17, 2013
doi:

概要

Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le ver<em> C. elegans</em>. Nous montrons comment construire vers exprimant Aß humain<sub> 42</sub> Dans les neurones et comment tester leur fonction dans des tests comportementaux. Nous montrons en outre comment obtenir cultures primaires de neurones qui peuvent être utilisés pour les tests pharmacologiques.

Abstract

Amylopathy est un terme qui décrit la synthèse anormale et l'accumulation de bêta-amyloïde (Aß) dans les tissus avec le temps. Aß est une caractéristique de la maladie d'Alzheimer (MA) et se trouve dans la démence à corps de Lewy, la myosite à inclusions et l'angiopathie amyloïde cérébrale 1-4. Amylopathies développer progressivement avec le temps. Pour cette raison, les organismes simples avec une durée de vie courte peuvent aider à élucider les aspects moléculaires de ces conditions. Ici, nous décrivons les protocoles expérimentaux pour étudier la neurodégénérescence Aß induite par l'utilisation des Caenorhabditis elegans du ver. Ainsi, nous construisons vers transgéniques par injection d'ADN codant pour Aß humain 42 dans les gonades syncytial des hermaphrodites adultes. Des lignées transformantes sont stabilisés par une intégration mutagenèse induite. nématodes âge synchronisée par la collecte et l'ensemencement de leurs oeufs. La fonction de neurones exprimant Aß 42 est testé dans des essais comportementaux opportuns (essai de chimiotaxies). Cultures primaires de neurones obtenus à partir d'embryons sont utilisés pour compléter les données comportementales et de tester les effets neuroprotecteurs de composés anti-apoptotiques.

Introduction

bêta-amyloïde (Aß) est un peptide de 36 à 43 acides aminés qui est formé après clivage séquentiel de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP) par β et γ d'une secrétases. La γ-sécrétase traite l'extrémité C-terminale du peptide Aß et est responsable de ses longueurs variables 5. Les formes les plus courantes de Aß sont Aß 40 et Aß 42, ce dernier étant le plus souvent associée à des états pathologiques tels que AD 5. A des concentrations élevées Aß forme β-feuilles qui s'agrègent pour former des fibrilles amyloïdes 6. Fibrilles dépôts sont la principale composante des plaques séniles autour des neurones. Les deux plaques et diffusables, les oligomères de Aß non-plaque, sont pensés pour constituer le sous-jacent pathogènes de Aß.

Etude en laboratoire des amylopathies neuronales est compliquée par le fait que ces conditions progrès avec le temps. Par conséquent, il est important de développer animaux génétiquement traitable modèles-complémentaire à des souris-avec durée de vie courte. Ces modèles peuvent être utilisés pour élucider les aspects spécifiques de amylopathies-général cellulaire et moléculaire et en raison de leur simplicité, de les aider à capturer l'essence du problème. Le ver Caenorhabditis elegans chutes est cette catégorie. Il a une durée de vie courte, ~ 20 jours et dans les processus cellulaires de base supplémentaires, y compris la régulation de l'expression génique, le trafic des protéines, de la connectivité neuronale, synaptogenèse, la signalisation cellulaire et la mort sont similaires à des mammifères 7. Les caractéristiques uniques du ver comprennent la génétique puissants et l'absence d'un système de navire, qui permet d'étudier les lésions neuronales indépendamment des dommages vasculaires. D'autre part, l'absence d'un cerveau limite l'utilisation de C. elegans pour étudier de nombreux aspects de la neurodégénérescence. En outre, la reproduction et l'identification des distributions anatomiques des lésions ne peuvent être exécutées dans cet organisme. Autre limitetions comprennent la difficulté d'évaluer les différences dans les profils d'expression des gènes et des troubles du comportement complexe et fonction de mémoire. Nous décrivons ici les méthodes pour générer C. elegans modèles de amylopathies.

Protocol

1. Construction des vers transgéniques Transformation. Préparer plaquettes d'injection. Déposer une goutte d'eau chaude, 2% d'agarose dissous dans l'eau, sur une lamelle de verre. Placer rapidement d'une seconde lamelle sur la goutte et tapoter sur elle. Après l'agarose est solidifié, des lamelles de diapositives à part, et cuire la lamelle-pad dans un four sous vide à 80 ° CO / N. Tirez pipettes. Nous utilisons une Sutter P-97 Extracteur de tirer 1/0.5 mm OD…

Representative Results

Avec nos protocoles, nous étudions les effets de l'homme Aß 42 oligomères sur la fonction neuronale 8. Un fragment codant Aß humain 42 et le signal de séquence codant pour un peptide artificiel de vecteur d'incendie pPD50.52 été amplifié à partir d'assemblage PCL12 9 en utilisant des amorces qui introduisent un site d'une endonucléase de restriction Sma aux extrémités. Le fragment a été ensuite inséré dans une construction contenant une séquenc…

Discussion

Nous décrivons ici une approche combinée, pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l'aide amylopathies C. elegans. Les avantages de cette approche sont les suivants: 1.) Faible coût C. elegans est maintenu dans un plat normale Petri ensemencées avec des bactéries, à la température ambiante. 2) génétique puissants. Les animaux transgéniques peuvent être obtenus en quelques mois et un large éventail de séquences promotrices est disponible pour conduire l'expression d…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Nous remercions le Dr Shuang Liu pour la lecture critique du manuscrit. Le PCL12 construction était un cadeau sous forme Dr. Christopher D. Link. Ce travail a été soutenu par deux Science Foundation subventions nationales (0842708 et 1026958) et une subvention AHA (09GRNT2250529) pour FS.</p>

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number コメント
      1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water     Bring to 975 ml
      Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer     25 ml of 1M stock
      2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
      Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
      6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9  
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199  
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN  
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG  
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320  
Lysine Sigma-Aldrich L5501  
Biotin Sigma-Aldrich B4639  
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044  
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289  
Sucrose Sigma-Aldrich S0389  

参考文献

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
  7. DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
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記事を引用
Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

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