私たちは、膵島抗原特異、プライマリーCD4 + T細胞の養子移入によって2週間以内に、マウスにおける1型糖尿病(T1D)を誘導するための再現可能な方法を提供する。
非肥満糖尿病(NOD)マウスは自発的に生後12週間後に自己免疫性糖尿病を開発し、人間の1型糖尿病(T1D)の中で最も広範囲に研究の動物モデルである。照射レシピエントマウスでセル転送研究はT細胞が、このモデルでT1D発症に極めて重要であることを確立した。我々は、本明細書に急速に精製され、プライマリCD4 +膵島特異的T細胞受容体(TCR)NOD.SCIDレシピエントマウスへのBDC2.5トランスジェニック前糖尿病NODマウス由来のT細胞の養子免疫伝達によってT1D誘導するための簡単な方法を述べる。糖尿病誘発T細胞の単離および養子移入は、同じ日以内に完了することができるこの技術の主な利点は、受信者の照射が必要とされないし、T1Dの高い発生率は、T細胞の転送後2週間以内に誘発される。したがって、T1Dにおける病因および治療介入の研究では、不均一なT細胞集団またはクローンに頼る方法よりも速い速度で進むことができます糖尿病NODマウス由来。
NODマウスは、自発的に自己免疫性糖尿病を発症し、広く人間T1D 1,2のための動物モデルとして使用されている。 NODマウスにおけるT1Dの病因は、T細胞とB細胞が続き、樹状細胞やマクロファージによるランゲルハンスの膵島の、生後3-4週で始まる、浸潤によって特徴付けられる。非破壊ペリ膵島炎のこの段階では、3歳の4〜6ヶ月まであからさまな糖尿病になり、インスリン産生膵β細胞の遅い、進行性の破壊につながる。 4,5脾細胞、CD4 +糖尿病NODマウスからの6,7またはCD8 + 8,9 T細胞の転送は、膵島反応性T細胞がT1D病因において中心的な役割を果たすことを示す、免疫不全NODマウスにおいて糖尿病を媒介することが示されている。実験条件に応じて、糖尿病は、これらの研究で数週間にわたって、徐々にレシピエントマウスで開発された。同様に、様々なT細胞クローンは時間とコストがかかることによって導出糖尿病誘発T細胞の培養は、数週間レシピエントマウス7,10への移行後に糖尿病を媒介することが報告されている。 CD4-CD8または拘束性糖尿病誘発T細胞クローンに由来するTCRを発現するトランスジェニックマウスの可用性と、いくつかの研究室は、その後、例えば、マウスからの脾臓T細胞は、レシピエント11-13に糖尿病を転送することができたことを示している。具体的には、BDC2.5 NODマウスは、クロモグラニンA、膵β細胞におけるタンパク質14-16に特異的なTCR BDC2.5、トランスジェニックである。あからさまに糖尿病または前糖尿病BDC2.5マウスからin vitroで活性化または非活性化の全体または画し脾臓細胞での転送効率を11,17-19を変えることで、新生児や免疫不全NODマウスに糖尿病を譲渡。
私たちは、精製されたトランスジェニックCD4を利用し簡単な方法+高効率とconsisteでレシピエントマウスにT1D誘導する前糖尿病BDC2.5マウスからT細胞を記述NCY。トランスジェニックTCRVβ4鎖を発現するナイーブ、膵島抗原特異的CD4 + T細胞はCD4ための蛍光活性化細胞選別(FACS)によって、これらのマウスから単離され+ CD62L + T細胞の多数。精製されたトランスジェニックT細胞を、次いで、官能性T細胞およびB細胞を欠き、膵島炎および糖尿病フリー20アールNOD.SCIDマウスに活性化せずに転送される。レシピエントマウスはT細胞移入後2週間以内に急速に発達T1Dを示す尿糖濃度の上昇のために監視されています。
他の方法とは対照的に不均一な特異性を有する糖尿病誘発性T細胞を移すことを、我々のプロトコルは、FACSソートしたCD4 +ほぼ独占的に糖尿病BDC2.5 TCRを発現したT細胞を使用しています。彼らの均質性に起因して、移入されたT細胞(〜1×10 6細胞/マウス)のほんの数は100%の発生率で2週間以内に急速T1D開発のために必要とされる。我々のプロトコルの別の利点は、irradiatioあるレシピエントマウスのnが、それはいくつかの他の方法のためにあるようにする必要はありません。この方法の潜在的な制限は、糖尿病の両方のCD4とCD8 T細胞サブセットまたは特にCD8 T細胞の寄与の調査を許可していないということです。
記述されたプロトコルは、ナイーブ、単一特異的CD4 +標的臓器への膵島抗原特異Th細胞のホーミングに介入するT細胞と同様に、治療戦略により仲介急速T1D開発を研究するために有用であろう。
T1Dは、糖尿病のNODマウスの糖尿病又はT細胞クローンに由来するTCRトランスジェニックマウスからの脾臓細胞全体またはT細胞サブセットの養子移入することにより効率を変化させることで、レシピエントマウスに誘導することができる。我々はここにNOD.SCIDマウスにFACS精製CD62L + BDC2.5ジェニックCD4 + T細胞を転送することにより、100%の発生率で2週間以内に、レシピエントマウスにT1D誘導する…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、博士に感謝します。有益なコメントをロバートBonneauとニールクリステンセン。
この作品は、医学資金のペンシルバニア州立大学によってサポートされていました。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | コメント |
BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Sterile surgical tweezers | |||
Sterile small pair scissors | |||
Sterile large pair scissors | |||
70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
Phase contrast microscope | |||
Trypan blue | |||
Hemocytometer | |||
Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
Heat lamp | |||
Mouse restrainer | |||
1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |