Meting van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) is de gouden standaard voor de nierfunctie beoordeling. Hier beschrijven we een high-throughput methode die de bepaling van GFR in bewuste muizen met een enkele bolusinjectie, bepaling van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-inuline in plasma en berekening van GFR door een bifasisch exponentieel model laat.
De meting van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) is de gouden standaard in de nierfunctie beoordeling. Momenteel, onderzoekers GFR bepalen door het meten van het niveau van het endogene creatinine biomarker of exogeen toegepaste radioaktief gemerkte inuline (3H of 14C). Creatinine heeft de aanzienlijke nadeel dat proximale tubulaire secretie goed voor ~ 50% van de totale renale uitscheiding van creatinine en daarom creatinine is geen betrouwbare GFR marker. Afhankelijk van het experiment uitgevoerd, kan inuline klaring bepaald worden door een intraveneuze injectie enkele bolus of continue infusie (intraveneus of osmotische minipomp). Beide benaderingen vereisen het verzamelen van plasma of plasma en urine. Andere nadelen van radioactief gelabeld inuline onder gebruik van isotopen, tijdrovende chirurgische voorbereiding van de dieren, en het vereiste van een terminal experiment. Hier beschrijven we een werkwijze die een enkele bolus injectie van toepassingenfluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) gelabeld inuline en het meten van de fluorescentie in 1-2 pl verdund plasma. Door een twee-compartimenten model met 8 bloedafname per muis, is het mogelijk GFR meten tot 24 muizen per dag met een speciale workflow protocol. Deze werkwijze vereist slechts korte isofluraananesthesie alle bloedmonsters werden verzameld in een niet-beheerste en wakker muis. Een ander voordeel is dat het mogelijk is om muizen te volgen over een periode van enkele maanden en behandelingen (bijvoorbeeld doet experimenten gecombineerd met dieet wijzigingen of drugtoepassingen). We hopen dat deze techniek van het meten GFR is nuttig om andere onderzoekers bestuderen muis nierfunctie en zal minder nauwkeurige methoden voor het schatten van de nierfunctie, zoals plasma creatinine en bloed ureum stikstof vervangen.
De snelheid van de vorming van plasma ultrafiltraat op de glomerulus is uitgegroeid tot de basis voor de evaluatie nierfunctie (glomerulaire filtratiesnelheid, GFR). De ideale marker om GFR te bepalen moet vrij worden gefilterd, noch afgescheiden of geabsorbeerd en niet gemetaboliseerd. Een dergelijk gedrag bleek te gelden voor inuline en inuline klaring is een gouden standaard voor het bepalen van GFR 3. Overwegende dat de klaring van creatinine grote schaal wordt gebruikt als maat voor de GFR bij mens en dier, doet creatinine niet aan de vereisten van een ideaal GFR marker. Ongeveer 10-40% van de creatinineklaring bij mensen is het gevolg van actieve tubulaire secretie 1, 11 en renale uitscheiding van creatinine is prominent in muizen en ratten 4, 7, 9, 22. Nierfunctieverlies is bekend dat de tubulaire uitscheiding van creatinine dat zijn waarde als een marker van GFR 1, 2 beperkt verhogen. We hebben eerder aangetoond dat organische anion transporter isovorm3 (OAT3) draagt bij aan muizen renale creatinine secretie 22. Echter, inulineklaring vereist typisch het gebruik van radioactief gelabeld inuline (3H of 14C). De radioactieve bepaling van inuline kan worden gebruikt in zowel muizen verdoofd en bewuste, maar bergt de nadelen van talrijke veiligheidsvoorschriften en strikte handlingsvraagstukken inherent aan het gebruik van radioactieve isotopen. Langs deze lijnen, chirurgische klaring voorbereidingen voor de bepaling van de GFR zijn tijdrovend evenals terminal in de natuur. In 1999 Lorenz et al.. 12 geïntroduceerd FITC-inuline als een marker van enkele nefron GFR in verdoofde muizen. Vijf jaar later Qi et al.. 15 bepaald gehele nier GFR in bewuste muizen met behulp van FITC-inuline. Alternatieve protocollen zijn nu met behulp van FITC-inuline als een exogene marker om GFR te meten in bewuste en verdoofde muizen. Deze protocollen behouden gevoeligheid van radioactieve inuline met fluorescentie detectiop en het omzeilen van de nadelen van het werken met een radioactief gelabelde marker. De FITC-inuline assay werd gemodificeerd door anderen 7, 8 en ons 22, 23 om te profiteren van het vermogen van de microvolume NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Dit maakt het mogelijk het verminderen van de totale steekproef volume nodig om <100 ul bloed per GFR meting.
Met de werkwijze en high throughput protocol in deze publicatie, demonstreren we de uitvoerbaarheid van meet GFR in maximaal 24 bewuste muizen per dag. Deze techniek kan nuttig zijn voor andere onderzoekers bestuderen van muizen GFR te zijn en we hopen dat het zal minder nauwkeurige methoden als indices voor de nierfunctie, zoals creatinine en bloed ureum stikstof vervangen.
De huidige studie beschrijft een techniek voor de bepaling van GFR in bewuste muizen bij een enkele bolus-injectie en analyse van fluorescentie in 8 bloedmonsters door bifasisch exponentieel verval. Een GFR meting in 1 muis duurt 75 minuten. Door een speciale stroomdiagram is het mogelijk om de GFR van 6 muizen in 130 min meten. Het is onmogelijk dit stroomdiagram protocol herhalen tot 4 maal per dag en meet GFR in 24 muizen. We pasten deze methode waardoor het mogelijk is om bloed te verzamelen van een kleine staart knip plaats staartader punctie, die sneller en gemakkelijker voor onderzoekers te voeren vergelijking staartader punctie. Door 10 pl hematocriet haarvaten en een 1:10 verdunning is het mogelijk om de totale hoeveelheid bloed nodig <100 pl verminderen. Tenslotte wordt de fluorescentie gemeten met een NanoDrop 3300 fluorospectrometer, waarbij de vaststelling van fluorescentie laat in 1-2 pi van verdunde monster. Deze methode zal de geïnteresseerde investigato gevenra werkelijke GFR waarde. In tegenstelling, creatinine metingen in muizen hebben verschillende zwakheden waaronder "creatinine blind range" en problemen met betrekking tot specifieke en gevoelige vastberadenheid. De "creatinine blinde range" beperkt haar functie als een marker voor GFR omdat serum creatinine blijft in de normale range tot 50% van de nierfunctie verloren is gegaan 19. Aangezien verschillende onderzoekers maken gebruik van genetisch gemodificeerde muizen in hun onderzoek naar nier fysiologie en pathofysiologie bestuderen, deze van het volgende probleem: uitgaande van een knock-out muis van gen X zou een aanzienlijk lagere GFR (met 40%) in vergelijking met een wild-type muis, een hebben eenvoudige screening door het vergelijken van plasma creatinine zou dit verschil niet detecteren. De noodzaak van een goede nauwkeurige methode GFR bepaling kritischer hoe kleiner de verschillen in GFR worden.
Muizen hebben hoge concentraties niet-creatinine chromagens in hun plasma en urine die interfereren met commercieelbeschikbaar creatinine assays. Bijgevolg assays die gebaseerd zijn op de alkalische picraat Jaffe reactiemengsel overschatting creatinine-concentratie in plasma ten opzichte van high performance liquid chromatografie (HPLC) bepaling 6, 13. Een andere beperking is dat de serumcreatinine is beneden de detectielimieten van de verschillende commercieel verkrijgbare assays in vergelijking met HPLC-bepaling. Echter, door enzymatische reacties onderzoekers waren in staat om te bepalen plasma creatinine bij muizen 10, 22.
GFR in een vergelijkbare reeks gevonden in bewuste muizen met een vergelijkbare enkelvoudige bolusinjectie werkwijze alsmede urine FITC-inulineklaring 14. In tegenstelling tot hun protocol, maakt ons protocol met staart snip geen speciale voorzorgsmaatregelen om de integriteit schip te behouden ten opzichte van de staart ader of vene punctie. Voor de urine / plasma gebaseerd FITC-inulineklaring noodzakelijk is chirurgisch implantaat twee osmotische minipumps. Twee pompen moeten hoog genoeg steady-state plasma FITC-inuline concentraties die duidelijk onderscheiden van de achtergrond te bereiken. Dit vereist ook het gebruik van metabole kooien voor een volledige en getimed urineinzameling. De kooien moeten worden doorgespoeld met een verlies van 25-37% van FITC-inuline, die anders optreedt zonder spoelen.
De valkuilen van het gebruik van dit FITC-inuline methode beperkt. Onderzoekers moeten zich bewust zijn van het volgende: (i) te verzekeren dat er geen luchtbellen in de spuit wordt gebruikt voor injectie van het FITC-oplossing, moet (ii) volledig retrobulbaire injectie worden bereikt omdat de hoeveelheid ingespoten bepaalt de berekende GFR, en ( iii) muizen hoogstwaarschijnlijk urineren tijdens de 75 min GFR experiment, zo verontreinigd bloedmonsters met urine, die een zeer hoge FITC-inuline concentratie tot gevolg hebben van de nieren concentratievermogen.
Algemene voordelen of dit FITC-inuline methode zijn de volgende: (i) het is een niet-radioactieve technieken, (ii) is het mogelijk om metingen meerdere keren herhalen in dezelfde muis, (iii) de assay kan worden uitgevoerd in bewuste muizen, ( iv) geen urine Daartoe is het nodig, en (v) een high-throughput optie kan worden gebruikt. Nadelen voor de enkele bolus injectie maatregelen dient dialyse van FITC-inuline, dat kan worden overwonnen door een betere FITC-marker, FITC-sinistrin, dat nu beschikbaar is en kan transcutaan bepaald met een speciale geminiaturiseerde inrichting 18. Hoewel GFR wordt gemeten, is het niet mogelijk om fractionele uitscheiding van vloeistof of ionen gemeten met deze methode.
Samengevat, deze methode de haalbaarheid van een high-throughput werkwijze voor het meten van GFR bij bewustzijn muizen. Zo zou deze techniek van belang zijn voor andere onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bepalen van de nierfunctie bij muizen.
The authors have nothing to disclose.
Ik dank Dr Jessica Dominguez Rieg voor het kritisch lezen van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), een Carl W. Gottschalk Research Grant van de American Society of Nephrology, het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases O'Brien Centrum voor Acute Kidney Injury Research ( P30DK079337) en het Department of Veterans Affairs.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | コメント |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |