Somitogenesis is een ritmische ontwikkelingsproces dat ruimtelijk patronen het lichaam as van gewervelde embryo's. Eerder ontwikkelden we transgene zebravis lijnen die fluorescerende verslaggevers gebruiken om de cyclische genen die dit proces sturen observeren. Hier hebben we cultuur verspreid cellen van deze lijnen en het imago van hun oscillaties in de tijd in vitro.
Segmentatie is een periodieke en sequentiële morfogenetische proces in gewervelde dieren. Deze ritmische vorming van blokken van weefsel genaamd somieten langs het lichaam as is het bewijs van een genetische oscillator patroonvorming van het zich ontwikkelende embryo. In de zebravis, wordt de intracellulaire klok rijden segmentatie bestaat uit leden van de Haar / Hes transcriptiefactor familie georganiseerd in negatieve feedback loops. We hebben onlangs gegenereerd transgene fluorescerende reporter lijnen voor de cyclische gen HER1 dat de ruimtelijke en temporele patroon van oscillaties in de presomitische mesoderm (PSM) recapituleren. Met behulp van deze lijnen, ontwikkelden we een in vitro cultuur systeem dat real-time analyse van segmentatie klok oscillaties laat binnen enkele, geïsoleerde PSM cellen. Door het verwijderen van PSM weefsel van transgene embryo's en vervolgens verspreiden cellen van oscillerende gebieden op glazen bodem gerechten, we gegenereerd culturen geschikt voor time-lapse imaging van fluorescentie-signaal vanindividuele klokcellen. Deze aanpak biedt een experimenteel en conceptueel kader voor directe manipulatie van de segmentatie klok met ongekende eencellige resolutie, waardoor de cel-autonome en weefsel-level eigenschappen te onderscheiden en ontleed.
De periodieke vorming van segmenten langs de gewervelde lichaam as of somitogenesis, is het bewijs van een ruimtelijke en temporele oscillator in het zich ontwikkelende embryo. De voorkeur mechanisme voor het regelen somitogenesis wordt conceptueel beschreven door een "klok en golffront" model 1, waarbij de "klok" bestaande uit cellulaire oscillatoren, nu gedacht intracellulair worden aangedreven door de ritmische expressie van een reeks genen cyclisch 2, streept de formatie somieten de presomitische mesoderm (PSM). Als het embryo zich ontwikkelt, een rijping "golffront" in de PSM gaat in overleg met de regressie weefsel naar de achterkant, het vertragen en arresteren cellulaire oscillatoren bij het passeren 3. Samen is dit spatiotemporeel dynamisch systeem aangeduid als de segmentatie klok. De huidige aanpak om de segmentering klok overspanning bestuderen drie toenemende niveaus van organisatie van de genetische oscillator in enkelvoudige cellen tot lokale koppeling thbij optreedt tussen de cellen en uiteindelijk tot mondiale regulering van positionele informatie in het collectieve PSM weefsel 4.
Eerdere studies suggereren dat de cel-autonome segmentatie oscillator in zebravis bestaat uit genen en eiwit producten van het haar / hes transcriptie factorfamily, die worden verondersteld om een negatieve feedback lus te vormen door middel van transcriptionele repressie 5-7. De Delta / Notch signaalweg synchroniseert oscillaties tussen naburige cellen en regeling van de collectieve periode van de bevolking 8-10. Fgf signaalmoleculen geproduceerd in de tailbud lijken een gradiënt over de zebravis PSM bouwen, en worden daardoor hypothese bij te dragen tot het vertragen en arresteren oscillerende cellen in de voorste 11. Tot nu toe hebben de functionele rol van elk van deze moleculen in somitogenesis is onderzocht door genetische mutatie, morfolino injectie, heat-shock over-expressie, en antagonist drug Treatment van onderdelen van klokken en de signalering tussen cellen 5,7,10,12. Met behulp van deze verstoringen is segmentatie klokfunctie zijn afgeleid uit weefsel-niveau beschrijvingen van somite fouten en verlies van uniforme oscillaties in expressie van genen zoals cyclische HER1, her7 en delta C. Echter, bijna al deze gegevens zijn afkomstig uit vaste embryo's en niet om veranderingen die inherent zijn aan de dynamische functie van de segmentatie klok zijn nauwkeurig vast te leggen. Meer recent heeft meerdere embryo time-lapse imaging onthulde de eerste mutanten met veranderde oscillator periode, maar deze waarnemingen werden ook gemaakt op het weefsel niveau 7,13. Zo is het gedrag van de hypothese cel-autonome oscillator tijdens somitogenesis is niet waargenomen.
Statische momentopnamen van somitogenesis geven een onvolledig beeld omdat, inherent, het proces wordt aangedreven door een oscillerend systeem. Eerder werk in muis en kuiken cellen toonde aan dat niveaus van transcripten eiwit stijgen en dalen, maar de bemonstering van een ongeveer 2 uur oscillatie om de 30 of 45 min per se beperkt de verzamelde gegevens en dus de conclusies die kunnen worden getrokken 14,15. Studie van andere biologische oscillatoren, met name, circadiane klok heeft verwijderd van geënsceneerde metingen van gen-en eiwitexpressie verhuisde naar real-time monitoring met behulp van fluorescentie-en bioluminescentie verslaggevers 16,17. Deze tools zijn essentieel voor het aantonen klok eigenschappen van individuele cellen 18. Een bioluminescent reporter van de Hes1 cyclische gen ontwikkeld en kort kenmerk muis-PSM-cellen 19. De gemiddelde periode en variantie berekend voor een klein aantal cellen waaruit blijkt dat oscillaties aanhouden meerdere cycli in vitro. Echter, deze studies niet kwantitatief in op de stabiliteit en robuustheid van de oscillator frequentie en amplitude, of cellen spontaan kunnen in-of uitstappen oscillaties,en hoe de cellen behouden hun faserelaties. Bovendien, het effect van signaalmoleculen in het embryo op het cel-autonome klok niet rechtstreeks getest. Derhalve zijn deze fundamentele eigenschappen van de cel oscillator blijven volledig onbekend.
We hebben onlangs transgene vis lijnen met behulp van BAC recombineering 20 naar Venus (YFP) fluorescentie verslaggevers van HER1 meningsuiting 30 rijden ontwikkeld. Dergelijke lijnen exploiteren de regulerende signalen van de intacte chromosomale locus waarin ze zijn ingebed en herhalen de temporele dynamica en ruimtelijke patroon van HER1. Deze doorbraak zorgt voor real-time monitoring van genexpressie in de ontwikkelingslanden zebravis embryo in vivo. Om de fundamentele eigenschappen van de cel-autonome oscillaties en hoe dergelijke expressie wordt na verloop van tijd geregeld bestuderen, hebben we onlangs ontwikkelde een betrouwbare methode om te isoleren en op te nemen van PSM cellen in vitro. Dit protocol beschrijft hoe we onze transgene reporter lijnen zijn gebruikt om verspreide celculturen, van waaruit we de oscillaties van de zebravis segmentatie klok karakteriseren in enkele cellen te genereren. We kunnen onopgeloste vraagstukken in het veld die niet toegankelijk met statische of weefsel-level analyse waren, evenals de segmentatie klok rechtstreeks te manipuleren op het eencellige niveau signaalstoffen en remmers daardoor pakken.
Om een cellulair proces dat plaatsvindt in de loop van de embryonale ontwikkeling te bestuderen, biologen meestal gebruik maken van een aanpak in het kader van de gehele embryo. Echter, om volledig te begrijpen hoe een enkele cel gedraagt zich binnen een ontwikkelingsstoornis tijdsbestek, een methode te onderzoeken en te verstoren individuele cellen in afzondering is ook zeer gunstig. Door het genereren van verspreide PSM celculturen met behulp van transgene zebravis embryo's hebben we nu een tool om direct te bestuderen de cel autonome karakter van genetische oscillaties in segmentatie klok op een kwantitatieve manier. Het is mogelijk om de dynamiek van de oscillaties meten onze fluorescente reporter honderden cellen onder verschillende omstandigheden.
De waargenomen periode van enkele cellen in kweek is langer dan de somitogenesis periode in de intacte embryo. We constateren dat een intact PSM explant in cultuur vertoont ook langzamer oscillaties dan het intacte embryo (gegevens niet getoond), wat suggereert that de langere periode waargenomen in geïsoleerde cellen is niet alleen te wijten aan schade door verspreiding. Een variabele periode en amplitude wordt waargenomen in de meeste van onze eencellige tijdreeksen. De bron van deze variabiliteit is onbekend, maar moet belangrijke details over tempo maken circuits van de segmentatie klok onthullen.
Met deze methode kunnen we de genetische componenten van segmentatie op cellulair niveau en adres vragen die uitdaging te onderzoeken in het gehele embryo bestuderen. Bijvoorbeeld, door gereguleerde toevoeging van bekende signaalmoleculen in het ontwikkelende embryo voor onze culturen, kunnen we de effecten op de enkel PSM cellulaire oscillator op een robuuste en reproduceerbare test onderzocht. Onze PSM cultuur systeem opent de deur naar een strenge evaluatie van welke factoren, alleen, of in combinatie te bevorderen oscillaties in deze cellen, welke factoren deze oscillaties te remmen, en de wisselwerking tussen deze moleculen te testen. Met deze tools in de hand, willen weevalueren bestaande modellen somitogenesis die zijn gebaseerd op gepubliceerde weefsel-level data, alsmede het gebruik resulteert in enkele cellen voorspellingen kunnen worden getest in het gehele embryo genereren.
Voor zover ons bekend, is dit de eerste zebravis primaire celkweek protocol voor acute time-lapse opname van fluorescentie in enkele cellen; verdere ontwikkeling en verfijning van dit protocol is geen twijfel mogelijk. Andere protocollen gebruiken vaak zebravis embryo om stabiele cellijnen kunnen worden getransfecteerd met reporters en gebruikt voor langdurige beeldvorming 27-29 genereren. Hoewel stabiele lijnen zijn nuttig voor het afbeelden van een proces dat niet gebonden is aan ontwikkeling timing, zoals de circadiane klok, de vraag embryonale segmentatie vereist directe beeldvorming terwijl cellen nog in de oscillerende progenitor staat. Zodra cellen stoppen met oscillerende, ze gaan uit van een gedifferentieerde cel lot, en wanneer in het weefsel, zou in een somiet worden opgenomen. Het is possible dat met de juiste factor of factoren aanwezig in vitro konden we PSM-achtige zebravis celkweeklijnen dat oscillerende zou blijven, waardoor aanzienlijk langere termijn observaties, meerdere opeenvolgende storingen, of high-throughput screening genereren.
Wij verwachten dat deze werkwijze voor de bereiding primaire kweken van verspreide cellen voor time-lapse imaging is zeer geschikt voor de studie van een cellulair proces dat plaatsvindt binnen een ontwikkelingsstoornis tijdsbestek dat is niet aanspreekbaar gebruik stabiel zebravis cellijnen. De isolatie van verschillende celtypen in verschillende ontwikkelingsstadia van de juiste transgene reporter lijnen, hetzij via dissectie of via FACS na embryonale dissociatie, kan het uitgangsmateriaal cellen. Sommige optimalisatie van kweekomstandigheden, geleid door de embryonale oorsprong van de cellen nodig zijn. Door het combineren van deze flexibele en gevoelige protocol met de snel groeiende collectie van transgene zebravislijnen, hopen we een in vitro ontwikkelingsbiologie aanpak die complementair is aan de klassieke genetische en embryologische methoden te vergemakkelijken.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een EMBO Langdurige fellowship (ABW), een National Science Foundation International Postdoctoraal Research Fellowship (ABW), het Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), een DIGS-BB fellowship (AO), en de Europese Onderzoeksraad in het kader van de Europese Gemeenschappen zevende kaderprogramma STG-207634 (DS, ACO). Wij danken Ravi Desai voor nuttig commentaar op het manuscript. We willen ook graag de MPI-CBG eiwitexpressie faciliteit bedanken voor de productie van de zebravis Fibronectin1 fragment, de MPI-CBG vis faciliteit personeel voor de zorg en het onderhoud van onze vis lijnen en de MPI-CBG lichtmicroscopie faciliteit voor de beeldvorming ondersteuning.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | コメント |
Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | |||
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |