تصميم واستخدام المصفوفات ناظم كيميائي تعدد في الإرسال
概要
قمنا بتطوير والتحقق من صحة مجموعة صغيرة من البصمة الكيموستات مصغرة مبنية من قطع جاهزة للتكلفة منخفضة. وكانت نتائج تطور الفسيولوجية والتجريبية مماثلة لالكيموستات حجم أكبر. مجموعة ministat توفر منصة مدمجة، وغير مكلفة، ويمكن الوصول إليها عن تجارب ناظم كيميائي التقليدية، وعلم الجينوم وظيفية، والتطبيقات الكيميائية الفرز.
Abstract
الكيموستات هي أنظمة المستمر في الثقافة التي تزرع الخلايا في بيئة تسيطر عليها بإحكام ثابتة كيميائيا حيث يتم تقييد كثافة الثقافة عن طريق الحد من العناصر المغذية المحددة. 1،2 البيانات من الكيموستات هي استنساخه للغاية لقياس الظواهر الكمية لأنها توفر معدل نمو ثابت والبيئة في حالة مستقرة. يمكن لهذه الأسباب، الكيموستات أصبحت أدوات مفيدة لغرامة على نطاق وتوصيف علم وظائف الأعضاء من خلال تحليل التعبير الجيني 3-6 و غيرها من خصائص الثقافات في حالة استقرار التوازن .. 7 تجارب طويلة الأمد في تسليط الضوء على مسارات محددة الكيموستات أن السكان الميكروبية اعتماد خلال التطور على التكيف في بيئة تسيطر عليها. في الواقع، وقد استخدمت الكيموستات لتطور التجريبية منذ اختراعهم. 8 A نتيجة مشتركة في تجارب التطور البيولوجي لكل تكرار للحصول على ذخيرة فريدة من الطفرات9-13 هذا التنوع يشير إلى أن لا يزال هناك الكثير ليتم اكتشافها من قبل إجراء التجارب مع تطور الإنتاجية أكبر بكثير.
نعرض هنا تصميم وتشغيل بسيط نسبيا، مجموعة انخفاض تكلفة الكيموستات أو مصغرة ministats والتحقق من صحة استخدامها في تحديد وعلم وظائف الأعضاء في التجارب مع تطور الخميرة. هذا النهج ينطوي على نمو عشرات الكيموستات تشغيلها من واحدة المضاعفة مضخة تمعجية. يتم الاحتفاظ الثقافات في وحدة تخزين العامل 20 مل، والذي هو عملية لمجموعة متنوعة من التطبيقات. ويحدونا الأمل في أن زيادة الإنتاجية، وخفض النفقات، وتوفير بناء على تعليمات مفصلة العملية قد تؤدي أيضا إلى تحريك البحث والصناعية تطبيق هذا التصميم كمنصة عامة لوصف وظيفيا أعداد كبيرة من السلالات والأنواع، وعوامل النمو، وكذلك الوراثية المكتبات أو المخدرات.
Introduction
ديناميات تطور نمو الجراثيم والأحياء الدقيقة من الأمور الأساسية ل، والبيئة، وعلم الوراثة، والتكنولوجيا الحيوية. الأسلوب الأكثر شيوعا لزراعة الميكروبات في دفعة، حيث يتم تلقيح خلايا في منخفض الكثافة في المواد الغذائية الغنية مرق ونمت لالتشبع. على الرغم مباشرة لأداء باستخدام معيار المعدات المختبرية والثقافات دفعة تواجه بيئة الكيميائية تقلب وتغير تبعا لعلم وظائف الأعضاء الخلوية. وهذا يمكن أن البيئة غير متجانسة النمو يؤدي إلى آثار النمو والتوتر التي يمكن أن تحجب الثانوية الاختلافات الفسيولوجية خفية. يمكن تطور التجريبية عن طريق التحويل دفعة مسلسل الاختيار لمخاليط معقدة من النمو التدريجي مجموعات سكانية فرعية محددة، يعقد محاولات للاتصال التكيف مع الظروف انتقائية محددة. يمكن قياس الظواهر الكمية يكون من الصعب بسبب الضوضاء من عينة غير دقيقة وتوقيت الاختلاف في بعض السمات، مثل الوقت الضائع. الثقافات المستمر توفير بديلالنظام النمو حيث يمكن الخلايا المزروعة في بيئة بتكاثر متجانسة كيميائيا بمعدل نمو محدد للوصول إلى حالة فسيولوجية ثابتة. وبسبب هذه المزايا، والدراسات التجريبية والتطور توصيف الدولة الخلوية غالبا ما تستخدم في بيئة تسيطر عليها الثقافات مستمرة مثل ناظم كيميائي 14
التقدير من هذه المزايا أدت إلى عودة الاهتمام في الثقافات ناظم كيميائي. 15 قتيلا منذ بدء العمل بها في عام 1950، تم وضع نظم ناظم كيميائي 1،2 لتعمل على مجموعة متنوعة من المقاييس التي تتراوح بين لتر إلى لmicroliters ومجموعة متنوعة من التطبيقات 16 -19 هذه التصاميم المختلفة، والتي تتراوح من المفاعلات الحيوية المنتجة تجاريا للسفن glassblown إلى منصات مخصصة على microfluidics، حصة مبادئ التصميم العام. يحرك A غرفة الثقافة والهوائية (عادة فقاعات الهواء من خلال ذلك)، وبقي ما الميكروبات الواردة فيه متجانسةفرقت لي غرفة في جميع أنحاء الثقافة في جميع الأوقات. يضاف المتوسطة جديدة من تكوين مستمر ويعرف معدل بالإضافة إلى ذلك يتحكم معدل النمو ويؤثر على البيئة الكيميائية التي يمر بها الثقافة. تجاوز حجم يضع الثقافة في أنبوب النمو، ومن خلال هذا الفائض سيتم أخذ عينات ثقافة في نفس المعدل الذي يدخل الطازجة المتوسطة. وبهذه الطريقة الوصول بسرعة الثقافات دولة الفسيولوجية التي ثابتا عند العديد من العوامل البيولوجية تظل ثابتة. على الرغم من مزايا الكيموستات والتقارير المقدمة من هذه المنصات المختلفة في الأدب، وقد تم اعتماد واسع النطاق من قبل تقتصر الصعوبات في بناء وتشغيل هذه النظم، وارتفاع التكاليف المرتبطة الخيارات التجارية. وعلاوة على ذلك يمكن وصف كيفية صنع واستخدام هذه الأجهزة تكون مبهمة.
نقدم تصاميم وتعليمات لاستخدام مجموعة صغيرة من البصمة الكيموستات مصغرة مبنية من قطع متوفرة بتكلفة منخفضة. نحن OBServe المعلمات التجريبية متسقة للغاية والنتائج استنساخه عند مقارنة جهدنا لجهاز البيانات المبلغة عن الخميرة مثقف في حجم أكبر المفاعلات الحيوية التجارية. وهذا يشمل استنساخ لفيزيولوجيا الخلوية كما يتضح من خلال الوصول إلى حالة استقرار التوازن خلال 10-15 الأجيال والحصول على كثافة مماثلة في الثقافة التوازن. بالإضافة إلى ذلك، وأنماط التعبير الجيني بين تتفق ministats والتجارية منصة أكبر الحجم. استقرار معدل التخفيف، والكثافة البصرية استنساخ التعبير الجيني بين ثلاث ثقافات تكرار إظهار متانة برنامجنا. نعرض أيضا أن الطفرات تنشأ على نفس التكيف مماثلة الجداول الزمنية تطور التجريبية كما هو الحال مع الكيموستات حجم أكبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
زراعة ناظم كيميائي في ministats، كما هو الحال مع أي ناظم كيميائي، يتطلب الاهتمام بالتفاصيل والاضطراب اطلاق النار. منذ التلوث هو مصدر قلق كبير في تجارب زراعة مستمرة، ونحن نتطلع في المعتاد من خلال المجهر للتلوث الجرثومي والفطري عند التلقيح وكل الأجيال خلال 50 تجارب التطور الطويل الأمد. حتى الآن نحن لم يلاحظ التلوث عبر التجارب تطور 96 من أكبر من 300 الأجيال (المعطيات غير معروضة). لاختبار التلوث المتبادل بين ministats واحتمال لاستعمار الميكروبات للغرفة الثقافة عن طريق خط الصرف ركضنا 16 ministats بحيث تم تلقيح كل ministat أخرى مع الخميرة وكما سبق لم تلقيح ما تبقى مع أي ثقافة. وأخذت عينات من الثقافات في وعاء النفايات البلدية، الذي أفرغ كل يوم. وبالتالي إذا كان من الممكن للملوثات للدخول من خلال خط الصرف كنا المرجح لاحظ أنه في هذه experimالأنف والحنجرة. خلال ثلاثة أسابيع، وأكبر من 100 أجيال من النمو في هذا النمط من الثقافات تلقيح الشطرنج وغير الملقحة، ونحن لم نلاحظ النمو في غير تلقيح أنابيب الثقافة ministat، مما يشير إلى أن التلوث من الخميرة أو الميكروبات الأخرى خارج من غير المرجح أن يحدث في تجارب اطر زمنية مماثلة.
على الرغم من تصميم ministats للعمل بطريقة مشابهة لالكيموستات التجارية، وطبيعة وحدات من هذا الترتيب يسمح لتعظيم الاستفادة لتناسب احتياجات المستخدمين والميزانية. يمكن للمضخة تحوي المستخدمة في هذا البروتوكول تحقيق معدلات التدفق بين 0،0186 المجلد / ساعة إلى 3.6 المجلد / ساعة (لا تظهر البيانات). ويمكن تحقيق زيادة الرقابة على أسعار التخفيف مع نماذج مضخة بديلة. لاحظ أن العملية في انخفاض معدلات التخفيف قد تتطلب استبدال إبرة قياس أعلى لتحقيق نفس التردد من تسليم الحبرية. حجم السكان هو أحد الاعتبارات الهامة لتصميم التجارب السليم للتطور.معدل تخفيف تركيز المغذيات القياسية والمستخدمة هنا يوفر الحجم السكاني الكبير نسبيا (~ 10 9 خلايا) من نفس النظام من حيث حجمها الدراسات المنشورة التطور. يمكن الإبقاء السكان 11 أكبر أو أصغر من خلال تغيير حجم العمل أو الحد من تركيز المغذيات. ويمكن أيضا زيادة إمدادات طفرة يمكن الحصول عليها من خلال العمل مع سلالات ذات معدلات مرتفعة الطفرة.
يمكن أيضا أن تتحسن أكثر من ministats دينا تصميم الحالي. ليمكن التكثيف المثال جمع على جدران أنبوب الثقافة وتقلص إلى حد كبير ويمكن باستخدام بالحمام المائي العميق، حاضنة، أو ثابت درجة حرارة الغرفة. على الرغم من تراكمها والنمو في الثقافات الجدار محدودة كبريتات يبدو أن نادر نسبيا، والتي تظهر تطور في التجارب 5/48 بنسبة 300 الأجيال (البيانات لا تظهر)، ومجموعة متنوعة من السطحي المتاحة التي قد تساعد في خفض أو تأخير هذه الصفة. في حالة التثاقل يتداخل مع الثقافة الكافيةويمكن تحقيق الاختلاط والاضطراب عن طريق الحد من زيادة عدد من الطرق وينقسم كل مضخة الهواء، أو عن طريق إضافة أجهزة التحريك. ويمكن أيضا تحقيقات إضافية لتركيز الغاز المذاب، ودرجة الحموضة، أو غيرها من المعالم إدراج، كما هو الحال في بعض التصاميم الأخرى 17
على الرغم من التعديلات المحتملة، وذلك باستخدام ministats كما هو موضح في هذا البروتوكول، لاحظنا المعلمات التجريبية متسقة للغاية والنتائج استنساخه عند مقارنة جهدنا لجهاز البيانات المبلغة عن الكيموستات حجم أكبر التجارية. هذا وشملت استنساخ لفيزيولوجيا الخلوية كما يتضح من خلال الوصول إلى حالة استقرار التوازن خلال 10-15 الأجيال (الشكل 2A) والحصول على كثافة مماثلة في الثقافة التوازن. كانت أنماط التعبير الجيني متسقة عبر ثلاث مكررات البيولوجية في ministats وبين ministats والتجارية الكبيرة الحجم منصات (الشكل 2B)، مع استثناء من الجينات استقلاب الحديد. هذه إكسبهي سبب الخلافات المرجح ression من التغييرات في محتوى المعادن من الجهازين أو تحسينات في نوعية المكونات وسائل الإعلام. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن ministats ستكون مفيدة للتجارب علم وظائف الأعضاء أو المنافسة التي تتطلب بيئة متناسقة.
لاختبار إذا كان تصميم ministat كافية للتطبيقات التجريبية تطور الثقافات تطورت ونحن تحت قيود سلفات ل 250 الأجيال وتستخدم لوصف CGH التضخيم في مكان الجريمة SUL1 – وهو السمة المميزة لتطور طويل الأمد في ظل هذه الظروف في الكيموستات أكبر حجم من 10 لاحظنا التضخيم من SUL1 في استنساخ من 4/4 تجارب تطور مستقل في وسائل الإعلام سلفات محدودة (الشكل 2C). ككل هذه البيانات تشير إلى أن ministats هي منصة القوية التي قد تكون مفيدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات التقليدية ناظم كيميائي. على الرغم من أننا أظهرت استخدامها في زراعة الخميرة في مهدها، ينبغي للministatsكما تكون متوافقة مع غيرها من الكائنات والتصاميم مماثلة في الواقع لقد استخدمت لزراعة البكتيريا والخميرة الأنواع الأخرى. 16،17،25 وعلاوة على ذلك حجم أصغر الثقافة وترتبط الحاجة انخفضت لوسائل الإعلام أن تقدم بديلا جذابا ministats للتجارب التي تتطلب باهظة الثمن أو غريبة الكواشف يمكن أن يكون كما هو الحال في شاشات كيميائية أو وراثية.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد إنشاء الفيديو من المنح المقدمة من المركز الوطني لبحوث الموارد (5P41RR011823-17) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (8 P41 GM103533-17) من المعاهد الوطنية للصحة. كما أيد هذا العمل من قبل NSF منحة 1120425. MJD هو ألين ريتا مؤسسة الباحث. ويدعم AWM في جزء من المعاهد الوطنية للصحة HG00035 T32. نشكر آنا صن شاين للمساعدة في تحسين البروتوكولات. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نعترف سارة DiRienzi، باين سيليا، وSirr ايمي كمستخدمين في وقت مبكر من ministats.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| 1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| 1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
| Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
| Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
| Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
| Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
| Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
| Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
| Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
| Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
| Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
| PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
| 1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
| #8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
| 4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
| 55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
| Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
| Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
| Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
| Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
| 8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
| 10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
| Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
| Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
| Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
| Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
| 5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
| Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
| 205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
| 16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
| Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
| 6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
| Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
| Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
| Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
| 47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
| Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
| Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
参考文献
- Monod, J. Récherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 15, 715-716 (1950).
- Daran-Lapujade, P., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. Chemostat-based micro-array analysis in baker’s yeast. Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).
- ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).
- Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation. 101, 3148-3153 (2004).
- Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors. Mutation Res. 1, 113-120 (1964).
- Gresham, D., Dunham, M. J., et al. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Kvitek, D. J., Sherlock, G. Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape. PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).
- Helling, R. B., Adams, J. Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment. 遺伝学. 116, 349-358 (1987).
- Dunham, M. J. Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide. Methods Enzymol. 470, (2010).
- Hoskisson, P. A., Hobbs, G. Continuous culture – making a comeback. 微生物学. 151, 3153-3159 (2005).
- Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).
- Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas. Biotechnol. and bioeng. , (2012).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures. Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).
- Torres, E. M., Amon, A., et al. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317, 916-924 (2007).
- Regenberg, B., Nielsen, J., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. Journal of Biology. 6, 4 (2007).
- Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
- Ferenci, T. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).
