אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים Ca<sup> 2 +</sup> מדידות בשילוב עם לימודי תיקון-מהדק אלקטרו.
המחקר של מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק וחקר הלב הסלולרי Ca 2 + מומים טיפול דורש cardiomyocytes מבודד. בנוסף, האפשרות לחקור myocytes מחולים תוך שימוש בטכניקות אלה היא דרישה לא יסולא בפז על מנת להבהיר את הבסיס המולקולרי של מחלות לב כגון פרפור פרוזדורים (AF). 1 כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם אשר מתאימות לשניהם מחקרי תיקון-מהדק ומדידות בו זמניות של 2 + ריכוזי Ca תאיים. ראשית, נספחים פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח מבותרים לחתיכות קטנות של רקמה ("נתח שיטה") ורחצו בCa 2 + ללא פתרון. ואז את נתחי הרקמות מתעכלים בcollagenase ופרוטאז המכילים פתרונות עם 20 מיקרומטר Ca 2 +. לאחר מכן, myocytes המבודדים הוא הארוויsted על ידי סינון וצנטריפוגה של ההשעיה הרקמות. לבסוף, Ca 2 + הריכוז בפתרון אחסון התא מותאם לשלבי 0.2 מ"מ. אנו דנים בקצרה את המשמעות של Ca 2 + וCa 2 + החציצה במהלך תהליך הבידוד וגם מספקים הקלטות מייצגות של פוטנציאל פעולה וזרמים בממברנה, שניהם בו זמנית יחד עם Ca 2 + ארעיות מדידות, שבוצע בmyocytes המבודדים אלה.
לימוד מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק והחקירה של הסלולר Ca 2 + מומים טיפול דורשים cardiomyocytes מבודד. אלה הם בדרך כלל מתקבלים בעקבות החשיפה במבחנה של דגימות רקמת לב לאנזימי עיכול (collagenase, hyaluronidase, peptidase וכו '). מאז הדו"ח הראשון של בידוד של myocytes לב קיימא בשנת 1955 2 כמות גדולה של פרוטוקולים פותחה במטרה לקצור cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים בודדים ממינים שונים, כולל עכבר, חולדה, ארנב, כלב, חזיר ואדם. בסקירה זו אנו מתמקדים בבידוד של myocytes פרוזדורי אדם. בנוגע לנהלים לבידודה של myocytes ממינים אחרים שאנחנו מתייחסים לאוכלוסיית "וורטינגטון רקמות דיסוציאציה המדריך" המסופק על ידי וורטינגטון יוכימית קורפ, ארה"ב (www.tissuedissociation.com).
<p class= "Jove_content"> פרוטוקולי בידוד myocyte פרוזדורי אדם בדרך כלל נגזרים מהשיטה שתוארה על ידי בוסטמנטה, et al. 3 כאן אנו מספקים תיאור צעד אחר צעד של טכניקה, אשר מותאם משיטה שפורסמה בעבר, על מנת להשיג myocytes פרוזדורים מתאים לא רק לניסויי תיקון-מהדק אלא גם עבור Ca 2 + מדידות תאיות בו זמנית. 4-11כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם מנספחי פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח. על מנת להשתמש בmyocytes אלה למדידות של cytosolic Ca 2 + מתאמנים שיטה שתוארה בעבר על ידי השמטת EGTA 4-11 מפתרון האחסון.
כבר בשנת 1970 זה היה ציין כי למרות שmyocytes לנתק בנוכחות של Ca 2 + במהלך עיכול, כולם היו בהתכווצות ואינו בת קיימא. 16,17 לכן, בידוד תא מתבצע בCa 2 + ללא פתרון. עם זאת, מחדש המבוא של ריכוזים פיסיולוגיים של Ca 2 + הביא המהיר Ca 2 + זרם ומוות של תאים. זו תוארה כ2 + תופעת פרדוקס Ca אשר נצפתה במקור בלבבות perfused ידי צימרמן וHulsman. 18 שינויים של תקשורת הבידוד כולל הפחתה של ה-pH 7.0, <sup> 19 תוספת של 20 taurin או של כמויות קטנות של 2 + (ראה שלב 3.2 ו -4.1) Ca, 21 כמו גם אחסון של myocytes מבודד בEGTA המכיל אחסון פתרון 22 כבר הציע על מנת למנוע את Ca 2 + פרדוקס. 17 עם זאת, זה ידוע היטב כי Ca 2 + חציצה באמצעות EGTA מקטין את המשרעת של L-סוג Ca 2 +-Induced Ca 2 + נוכחי אמפליטודות ותוצאות בריקבון biphasic של Ca 2 + הארעיים חולפות. 23 לכן, אנו הושמטו EGTA לאורך כל תהליך הבידוד על מנת לקבל Ca 2 + ארעיים עם מאפיינים טיפוסיים והתפרקויות monophasic. כדי להגן על התאים מCa 2 + פרדוקס הגדלנו 2 + ריכוז Ca הסופי של פתרון האחסון באופן הדרגתי עד 0.2 מ"מ.
הבחירה של collagenase היא כנראה השלב הקריטי ביותר לבידוד myocyte מוצלח. קול קונבנציונליagenases הם הכנות גולמי המתקבלות מקלוסטרידיום histolyticum ומכיל collagenase בנוסף למספר proteinases, polysaccharidases וlipases האחרים. בהתבסס על collagenases ההרכב הכללי שלהם מחולקים לסוגים שונים. -24 סוגי collagenase ורטינגטון I ו-II היו בשימוש בהצלחה לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. 4-10,15,25-30 בפרוטוקול המתואר כיום אנו ממליצים על השימוש בcollagenase הקלד, למרות שהיינו גם יכול להשיג כמויות מקובלות של תאי קיימא באמצעות collagenase סוג II. עם זאת, אפילו בתוך סוג collagenase אחת יש וריאציה אצווה כדי אצווה משמעותית ביחס לפעילות האנזים. וריאציות אלו דורשות בחירה אצווה זהירה ובדיקה של קבוצות שונות כדי לייעל את הליך בידוד. הכלי אצווה בחירה זמינה באינטרנט ומורטינגטון קורפ (ביוכימית http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) ניתן להשתמש כדי למצוא קבוצות זמינות עם הרכב שהוכח להיות מתאים לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. כיום אנחנו משתמשים בcollagenase הקלד עם פעילות 250 U / מ"ג collagenase, פעילות 345 U / מ"ג caseinase, פעילות 2.16 U / מ"ג clostripain ופעילות 0.48 U / מ"ג tryptic (הרבה 49H11338 #).
את התאים המתקבלים באמצעות ההליך המתואר בכתב היד הזה יכולים לשמש בתוך 8 שעות ללימודי תיקון-קלאמפ, Ca 2 + מדידות חולפות, ושילוב של שניהם. 15 בנוסף, תאים אלה מאפשרים מדידות של התכווצות סלולרית בתגובה לגירוי שדה החשמלי או גירוי חשמלי באמצעות פיפטה את תיקון המהדק (תצפיות שלא פורסמו).
The authors have nothing to disclose.
כמו כן, אנו מודים למנתחי הלב באוניברסיטת היידלברג למתן רקמת פרוזדורים אנושיים וקלאודיה Liebetrau, קטרין Kupser ורמונה נגל לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם. תודה מיוחדת גם לאנדי וו טראפורד להצעות המועילות שלו והייעוץ במהלך הקמת 2 + המדידות חולפות קליפורניה. המחברים מבקשים להביע את התודה העמוקה ביותר שלהם לחברי המחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה (ראש: העורבים אורסולה) מהאוניברסיטה טכנולוגית של דרזדן על ההזדמנות שהם הציעו לנו ללמוד טכניקות בסיסיות ומיומנויות בסלולריים electrophysiology ובידוד cardiomyocyte.
המחקר של המחברים הוא נתמך על ידי קרן המחקר הגרמני (Do769/1-1-3), משרד הגרמני הפדרלי לחינוך ולמחקר באמצעות רשת כשירות פרפור פרוזדורים (01Gi0204) ומרכז הגרמני לחקר לב וכלי דם, איחוד האירופי באמצעות האיחוד האירופירשת ropean למחקר Translational בפרפור פרוזדורים (EUTRAF, FP7-בריאות-2010, פרויקט שילוב בקנה מידה גדול, הצעת מס '261,057) והברית אירופית בצפון אמריקה פרפור פרוזדורי המחקר (ENAFRA) מתן הגט Leducq (07CVD03).
הסקירה סכמטית שמוצגת בקובץ הווידאו הופקה באמצעות אמנות רפואית Servier.
Transport solution | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
Collagenase I | Worthington | 4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
Table I. Solutions. | |||
Company | Catalogue number | ||
Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
Table II. Specific equipment. | |||
Company | Catalogue number | ||
Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
Company | Catalogue number | Bath solution | |
4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
pH | Bath solution: 7.35 | ||
adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
Company | Catalogue number | Pipette solution | |
DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
pH | 7.20 | ||
adjusted with | 1 M KOH | ||
Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||