Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

1. Einrichten einer Vorrichtung zum SSM-basierte Elektrophysiologie Einzelheiten sind in zwei unserer technischen Publikationen, die auch schematische Zeichnungen und Fotografien von unseren Küvetten und Einrichten 1, 2 gegeben. Unterschiedliche Konfigurationen Lösung Austausch und Durchfluss-Protokolle sind auch in unserer Methode Papier 2 diskutiert. Im Folgenden wollen wir noch ein paar letzte Verbesserungen und technische Details, die von unmittelbarer Bedeutung für die Video-Präsentation sind. Ventilsteuerung und Datenerfassung Die Interface-Box enthält einen handelsüblichen USB-Digitalausgang / Analog-Input-Schnittstelle (NI USB 6009 National Instruments) und die Ventil-Treiber. Es steuert die Lösung fließen und ist verantwortlich für die Datenerfassung. Ventile werden in der Regel mit 12 angetrieben V. Doch für schnelle Schaltzeiten der Ventile mit einer Spannung von bis zu 18 gefahren werden V. In dem Video verwenden wir eine 12 V Spannungsversorgung. </P> Das Ventil Treiber Leiterplatte betreiben vier Ventile. Es wurde von der Werkstatt des Max-Planck-Institut für Biophysik hergestellt. Ventile können per Computer oder manuell über Schalter an der Frontplatte gesteuert werden. Letzteres ist zum Spülen-und Reinigungsarbeiten-Verfahren bequem. Während der Messung ist die Interface-Box computergesteuerten mit einer Ventilsteuerung und Datenerfassungs-Software (SURFE 2 R-Software, IonGate Biosciences). 2. Vorbereitungen In diesem Abschnitt werden die verschiedenen Protokolle für die Herstellung eines SSM-basierte Elektrophysiologie Experiment genannt. 2.1 Herstellung der Lipid-Lösung für die Bildung des SSM Mix 25 ul Octadecylamine (5 mg / ml in Chloroform) und 375 ul Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml in Chloroform) in einem Glas Fläschchen. Unter Verwendung eines Rotationsverdampfers und kontinuierlichen Strom von Stickstoffgas, dampft das Chloroformca. 30 min. Entfernen Sie das Lipid aus den Wänden der Glasampulle durch Schütteln mit 500 ul n-Dekan. Die endgültige Lipidkonzentration 15 mg / ml mit 1:60 (w / w) Octadecylamin. Die Lösung wird in das Glas Lagervials. Bewahren Sie die Lipid-Lösung bei -20 ° C. 2.2 Chlorierung des Referenz-Elektrode Die Referenzelektroden müssen in regelmäßigen Abständen durch Abrieb chloriert werden. Entfernen Sie den Rest des alten Silberchlorid Schicht mit feinem Sandpapier vor der Chlorung. Setzen Sie den Silberdraht zusammen mit einem Platin-Elektrode in eine 1 M Salzsäure-Lösung und chloren für 15 min bei 0,5 mA. Nach Chlorierung, ändert der Silberdraht seine Farbe zu einer homogenen dunkelgrau. 2.3 Herstellung des Polyacrylamidgel Brücke Bereiten einer Lösung, die 100 mM KPi bei pH = 7, 100 mM KCl und 6% Acrylamid. In 0,3% APS (10% Lager) und 0,6% TEMED und kurz mischen die Lösung mit einer Pipette. Unmittelbar nach dem Mischen der Lösung mit einer Pipette 30 ul der Mischung in den leeren Gelbrücke Behälter zu injizieren. Es ist wichtig, um Luftblasen während der Injektion zu vermeiden. Während einer Inkubationszeit von 20 min das Gel polymerisiert. Nach der Polymerisation wird das Gel Brücke wird in Lösung (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCl) gespeichert. Um die Lebensdauer der Brücke zu verlängern Gel wird die Lösung bei 4 ° C gelagert 2.4 Herstellung der Messlösungen Aufgrund der starken Wechselwirkung der gelösten Stoffe mit dem SSM werden elektrische Artefakte erzeugt werden, wenn Lösungen unterschiedlicher Zusammensetzung ausgetauscht werden. Daher ist die Herstellung der Lösungen ein kritischer Schritt. Nehmen Sie die folgenden Vorsichtsmaßnahmen bei der Zubereitung der Lösung Prozess Lösung Austausch Artefakte zu minimieren. Als Nicht-Aktivierung und Aktivierung Lösungen aus einer Charge, den pH-Wert und Ionenstärke. Hohe Salz Hintergrund hilft Lösung Austausch Artefakte zu reduzieren. Teilen Sie die Batch-Lösung in zwei Bänden. Fügen Sie die aktivierende Verbindung zum aktivierenden Lösung. Verwenden Sie eine kompensatorische Verbindung in der nicht-aktivierenden Lösung, um die Osmolarität und Ionenstärke der beiden Lösungen so ähnlich wie möglich zu halten. Wenn die Lösungen bei 4 ° C gelagert werden, um sicherzustellen, dass alle Lösungen Raumtemperatur erreicht, bevor eine Messung, denn auch kleine Unterschiede in Temperatur Artefakte produzieren kann. 3. Ein SSM-basierte Elektrophysiologie Experiment Hier präsentieren wir Ihnen ein typisches Protokoll für ein SSM-basierte elektrophysiologische Experiment. 3.1 Vorbereiten des SSM-Setup Während die SSM-Setup ist nicht in Gebrauch sind die Rohre mit einer 30% Ethanol gefüllt/ Wasser-Lösung, um das Bakterienwachstum zu verhindern. Waschen Sie das System mit reinem Wasser, um das Ethanol aus dem Schlauch zu entfernen, bevor Montage der Küvette. Ersetzen Sie die Behälter mit Wasser Ethanol Behältern. Mit hohem Druck (0,6 bis 1,0 bar) reinigen Sie das System mit 20-30 ml Wasser. Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang mit einem 100 mM KPi Puffer bei pH 7,6 oder nicht-aktivierende Lösung. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Flüssigkeit System verbleiben. 3.2 Montage der Küvette Bringen Sie einen O-Ring auf die Referenz-Elektrode Nehmen Sie die Gel-Brücke aus dem Storage-Lösung und verbinden Sie das Referenz-Elektrode. Prefill der Auslass-Anschluss mit nicht-aktivierende Puffer, legen Sie einen O-Ring und verbinden Sie das Gel Brücke, um die Referenz-Elektroden-Einheit abzuschließen. Besondere Vorsicht, dass keine Luftblasen an der Kreuzung des Gels Brücke und dem Auslass Lösung Strömungsweg sind. Vormontieren Hauptteil des cuveTTE indem die Feder Kontaktstift (Verbindung zum Verstärker), das Einlaßrohr (Verbindung zu dem Endgerät Ventil) und den O-Ring (Dichtring für den SSM) und die Schrauben. Mit einer Pinzette, nehmen Sie den Sensor-Chip aus dem Speichern-Lösung (10 mM Octadecanthiol in Ethanol). Mit einer Pipette abwaschen die verbleibende Lösung mit ca.. 5 ml reinem Ethanol. Trocknen Sie die Elektrode unter Stickstoffgas. Den Sensor Chip genau an dem Basisteil der Küvette so dass die Zulaufbohrung des Hauptteils der Küvette wird in die kreisförmige aktive Fläche des Sensors gerichtet ist. 1 ul der Lipid-Lösung, um den aktiven Bereich des Sensorchips. Stellen Sie sicher, dass die Goldschicht vollständig von der Lipid bedeckt. Unmittelbar nach der Zugabe des Lipid-Lösung, schließen Sie die Küvette, indem Sie die vormontierte Hauptteil. Vor der Montage die Küvette in die Faraday-Käfig, sicher sein, dass alle Flächen vollständig trocken sind. Connect den Verstärker an die Federkontaktstift und der Einlassröhre zum Terminal Ventil. Dann befestigen Sie die Küvette mit den Schrauben im Inneren des Faraday-Käfig. Schrauben Sie den Stecker Steckdose an die Spitze der Küvette. Zum Schluss das Auslaufrohr mit dem Auslass-Anschluss und der Spannung Generator zur Referenzelektrode. Unmittelbar nach der Montage der Küvettenwaschstation das System mit Puffer bei 0,6 bar. Dies führt zu einer spontanen Bildung SSM. 3.3 Messung Membranparameter Um die Qualität des SSM zu überprüfen, sind Kapazität und Leitfähigkeit gemessen mit Hilfe der Funktion Generator. Mit der Funktion Generator, gelten 100 mV Gleichspannung um die Leitfähigkeit zu messen. Berechnen der Leitfähigkeit: Die Stromabfall zeigt die Aufladung des Kondensators Membran. Nachdem der Kondensator vollständig aufgeladen ist der gemessene Strom ergibt die Membran Leitfähigkeit mit Ohm-Gesetz. Aus Gründen der Einfachheit verwenden wir die current 1 Sekunde, nachdem die Spannung angelegt wird, um die Leitfähigkeit G = I / U. berechnen Tragen Sie eine dreieckige AC Spannung von 50 mV Spitze-Amplitude und eine Frequenz von 0,5 Hz, um die Kapazität zu messen Höhepunkt. Berechnen der Kapazität: Die Amplitude des resultierenden Rechteckstrom stellt die Ladeströme des Kondensators. Die Kapazität C ist gleich der übertragenen Ladung Q = IΔt von AU = 100 mV unterteilt. (AU ist das Doppelte der angelegten Spannung von 50 mV, weil ich die Differenz aktuellen positive minus negative Steigung des dreieckigen Spannung.) Überwachen Sie die elektrischen Parameter der Membran wiederholt alle 10 min für ca. 30 bis 40 min, bis konstante Werte erreicht. Waschen dazwischen mit KPi-Puffer bei hohem Druck im Bereich von etwa 0,6 bis 1 bar. Schätzen der Qualität des SSM: optimalen Parameter sind in dem Bereich von 0,1 bis 0,2 nS und 2 bis 3,5 nF. Eine hohe Leitfähigkeit über 0,8 nS und eine geringe Kapazität unter 1 nF zeigtdass die SSM nicht korrekt gebildet wird. Eine hohe Kapazität über 4 nF bedeuten kann, dass die aktive Zone nicht vollständig von der SSM bedeckt. Wenn die Parameter nicht im optimalen Bereich, sollte die Membran verworfen und andere SSM hergestellt, wobei ein frisch zubereitetes Elektrodenchip. 3.4 Prüfungen für Lösung Austausch Artefakte Nachdem die Membran Parameter überprüft wurden, sollte die Messung Puffer für Lösung Austausch Artefakte getestet werden. Legen Sie die jeweiligen Container-Lösung auf das Fluid-System. Entfernen Luftblasen aus dem Fluid-System, mit Hilfe der manuellen Ventilen. Mit der Software zur Datenerfassung wählte den Fluss Protokoll, das Sie wollen in Ihrem Experiment verwenden. Stellen Sie den Druck bis 0,6 bar und die Messung gestartet. Abgesehen von den mechanischen Schalten des Ventils Artefakte im Idealfall kein Artefakt Ströme gemessen werden, oder sie sollte viel SMA dieller als die erwarteten Protein-Transport-Signale. Wenn Lösung Austausch Artefakte beobachtet werden, versuchen, die Puffer Zusammensetzungen und / oder die Vorbereitung Verfahren vor der weiteren Experiment zu optimieren. 3.5 Hinzufügen der Proteinprobe Gewöhnlich Proteoliposomen oder Membranfragmente werden bei -80 ° C gelagert Vor jeder Messung wurde ein Aliquot von etwa 30 ul benötigt. Spülen Sie das SSM mit nicht-aktivierende Lösung. Tauen Sie das Protein Probe auf Eis. Drei 10-sec Ultraschallbehandlung Zyklen werden mit 10-sec Kühlintervalle auf Eis wechselten. Proteoliposomen werden beschallt mit einem Ultraschallbad. Für Membranfragmente ein Tipp Ultraschallgerät (50W, 30 kHz, 1 mm Durchmesser Sonotrode, Intensität 20%, Zyklus 0.5) verwendet wird. Nach dem letzten Schritt Beschallung nicht setzen die Probe wieder auf Eis, aber spritzen sie sofort in die Küvette. Lösen Sie die Ausgangs-Connector zusammen mit der Referenz-Elektrode Assembly. Mit einer Pipette absaugen 30 ul der Proteinprobe und montieren Sie die Pipettenspitze auf die Auslaßbohrung. Öffnen Sie die manuelle Ventil in der nicht-aktivierenden Weg zum Abfallbehälter und injizieren die Proteoliposomen in die Küvettenvolumens. Achten Sie darauf, um Luft in den Küvettenvolumens spritzen mit dem Sensor. Vor dem Entfernen der Pipettenspitze, schließen Sie das manuelle Ventil zur weiteren Lösung Strömung zu verhindern. Lassen Sie die Proteoliposomen an die SSM zu einer Inkubationszeit von 1 bis 2 Stunden zu adsorbieren. Es ist auch möglich, über Nacht inkubieren. 3.6 Allgemeine Vorgehensweise eines SSM-basierten Experiment Warm up die Messung Puffer in der Zeit, wenn bei 4 ° C gelagert Alle Mess-Puffer müssen bei Raumtemperatur vor der Messung, um Artefakte zu vermeiden. Beim Wechsel Lösungen, reinigen Sie zuerst die Rohre im Inneren der Behälter mit einer Lösung fusselfreien Gewebe, dann legen Sie die neuen Flaschen. Vor Beginn der Messung, verwenden Sie die manuelle Ventile, um Luftblasen, die aus dem sich ändernden Verfahren entwickelt haben könnte entfernen. Stellen Sie den Druck kurz vor Beginn einer Messung. Wir verwenden routinemäßig einen Druck von 0,6 bar, die an unsere spezifischen Ventil und Rohr-Konfiguration ergibt sich eine Flussrate von etwa 1,0 ml / sec. Die ersten Messungen durchgeführt werden können direkt nacheinander durchgeführt und sollte zurückgewiesen, bis die maximale Stromaufnahme konstant bleibt. Falls die in pH unterscheiden eine Inkubationszeit von mindestens 3 min erforderlich, um den pH-Wert der inneren Proteoliposomen vor Beginn der Messung einzustellen. Nun ist die Einrichtung ist für die Messung bereit. Um den Lärm zu reduzieren mindestens 3 Messungen sollten und gemittelt werden. 3.7 Kontrollmessungen Ein Signal rundown während einer Reihe von Messungen können aufgrund Proteinabbau oder einem Verlust der Adsorption. Jedes Experiment SSM sollte ichnclude ein heruntergekommenes Kontrolle. Dies geschieht durch wiederholte Messungen mit identischen Lösungen durchgeführt. Die minimale Verminderung Steuereinrichtung eine Messung am Anfang und einer am Ende des Experiments unter Verwendung der gleichen Lösung. Wir empfehlen, den heruntergekommenen Steuerung unter Bedingungen, bei denen Sie erwarten, dass die höchsten Gipfel Amplitude im Experiment zu tun. Dies macht es einfacher, die Verminderung des Signals zu quantifizieren. Das Signal heruntergekommenen durch einen Vergleich der Peak-Amplituden der beiden heruntergekommenen Kontrollen quantifiziert werden. Die resultierende prozentuale Wert kann verwendet werden, um die gemessenen Signale durch Annahme einer linearen Zeitabhängigkeit der heruntergekommenen korrigieren. 3.8 Artifact Kontrollen Wenn möglich, versuchen, um Ihre Ergebnisse durch die Hemmung des Proteins von Interesse validieren nach dem Experiment. Verbleibende Signale sind wahrscheinlich Lösung Austausch Artefakte. Die Signale müssen dann für die gemessenen Artefakte korrigiert werden. <p class = "jove_step"> 3.9 Nach dem Experiment Waschen des Systems mit 20-30 ml reinem Wasser und 20-30 ml 30% Ethanol / Wasser. Die ethanolische Lösung vermeidet Bakterienwachstum, wenn das System nicht in Gebrauch ist. Nach diesem Reinigungsvorgang, den Druck aus dem System und schalten Sie alle Geräte. Entfernen Sie die Küvette aus dem Faraday-Käfig und es absteigen. Alle Teile der Küvette mit Wasser und reinem Ethanol gereinigt werden, falls notwendig, mit einem Ultraschallbad. Platzieren Sie den Sensor-Chip in einem Glas Becherglas mit reinem Ethanol. Beschallen das Becherglas für etwa 1 bis 2 min mit einem Ultraschallbad. Trocknen Sie den Sensor-Chip unter Stickstoffgas. Bewahren Sie den Sensor-Chip weg vom Licht in einem 10 mM Octadecanthiol ethanolischer Lösung. Nach einer Inkubationszeit von etwa 30 min der Sensorchip ist bereit für die Wiederverwendung.