Transporte pneumocócica experimental humana

1. Voluntários de Seleção e Triagem Voluntários saudáveis ​​são recrutados por meio de anúncios de cartazes e no site da Universidade de acordo com a Pesquisa NHS e orientação Comitê de Ética. Os critérios de inclusão para participação são: Adultos com idade entre 18-60 anos. Fala fluentemente Inglês e é capaz de se comunicar facilmente por tanto o telefone móvel e mensagens de texto. Os critérios de exclusão para a participação são: O contato próximo com a indivíduos de risco (crianças, adultos imunodeprimidos, idosos, saúde crônica doente). História de tabagismo atual fumante ou significativa (anos> 10 maços). Asma ou outras doenças respiratórias. Gravidez. Alergia à penicilina ou amoxicilina. Participação atual em outro ensaio clínico, a menos observacional ou não-intervencionista fase. Incapaz de dar consentimento plenamente informado. Uma visita de triagem inicial, cerca de uma semana antes da inoculação, inclui uma história focada clínica e exame clínico-alvo. Se uma anormalidade até então desconhecida é encontrada, o voluntário será excluído do estudo e investigação apropriada será organizado através da atenção primária. Durante a visita de rastreio inicial de uma contagem de sangue completo é obtido a assegurar que a contagem de células brancas está dentro do intervalo normal, antes da visita de inoculação. A lavagem nasal é realizada para excluir portadores de pneumococos naturais (ver 6.1). Antes da inoculação, os voluntários são instruídos sobre os riscos envolvidos com a participação no estudo e são fornecidos com um folheto informativo de emergência, termômetro digital, números de telefone de emergência e três dias de curso de amoxicilina. 2. Preparação de Ações de inoculação Preparação dos stocks de inoculação deve ser feito num ambiente limpo. As pipetas usadas só deve ser usard para a preparação do inoculo. Todo o vidro e utensílios de plástico deve ser estéril. Nós recomendamos que os estoques de inoculação ser preparado de uma sala dedicada, utilizando um fumehood dedicado e incubadora. Estirpes pneumocócicas são inoculadas em uma placa de ágar sangue. As placas são incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2 durante a noite. No dia a seguir todas as bactérias é raspada da placa de agar de sangue e inoculadas em um sistema de preservação do grânulo estoque. Estes estoques de contas são utilizadas para preparação da inoculação. Teste os estoques talão de contaminação e uniformidade colônia antes de preparar um estoque de inoculação. Para preparar o stock de inoculação, inocular uma placa de ágar de sangue com dois rebordos do pneumococos do serotipo estoque desejado grânulo, listando-se a cobrir a totalidade da placa. Incubar as placas a 37 ° C em 5% de CO2 durante a noite. Todas as incubações adicionais irão utilizar as mesmas condições. Também incubar os meios Vegitone durante a noite para garantir a esterilidade. O cotonete manhã seguintemeia a placa, não tendo o cuidado de remover qualquer ágar sangue, e adicionar 12 ml de pré-aquecido caldo Vegitone. Repita usando a outra metade da placa. Deixar os dois frascos de 12 ml a 37 ° C durante 2 horas ou até que uma alteração na turvação torna-se aparente, o que ocorrer primeiro. Adicionar a 12 ml a 40 ml de caldo de pré-aquecida Vegitone e misturar completamente. Repita para o outro frasco ml 12. Este é o ponto de tempo = 0. Remover 100 ul para ler a densidade óptica (DO) a 600 nm. Remover 20 pi para a quantificação de bactérias formadoras de colónias por unidade (CFU) de contagem usando uma variação do método de Miles e Misra (M & M) 7. Incubar ambos os frascos. Para o M & M, dividir uma placa de ágar sangue em seis seções. Adicionar 180 ul de PBS estéril a seis poços de uma placa de 96 poços (fundo em U). Adicionar 20 ul de caldo para o bem de topo e misturar. Serialmente diluir a amostra 1:10 seis vezes e descartar 20 ul do poço sexto. Coloque três gotas 10 uL do bem superior na primeira seção doágar-sangue. Repetir para os cinco outros poços. Assegurar a placa é seca antes de ser invertidas e incubadas. No dia seguinte, contar o número de colónias visíveis em cada secção de diluição e de gravação. Usando o ponto de diluição com uma contagem de entre 30 e 300, dividir o número de colónias visíveis por três, para obter uma média. Multiplicar o número médio de colónias por o factor de diluição e, em seguida, dividir por 10 (o valor da queda de 10 uL). Isto dá UFC / ul. Multiplicar esse número por 1000 para obter CFU / ml. Realize OD 600 leituras e quantificação de bactérias por M & M método a cada hora até meados fase log precoce é alcançado, uma DO de 0,25. Uma vez que isto é alcançado OD, adicionar 10% de glicerol esterilizado para um frasco e preparar alíquotas de 1 ml. Alíquotas de armazenar a -80 ° C. A uma unidade mais concentrada, centrifugar a outra cuvete de 3.345 xg durante 15 min e remover o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 22,5 ml de Vegitone meio e adicionar 10% de glicerol. Preparar alíquotas de 1 ml e armazenar a -80 ° C. Deixar stocks a -80 ° C durante pelo menos 48 horas antes de descongelação e de quantificação. Quantificar o estoque de congelados bacteriana pelo método de M & M. Teste três tubos de ações individualmente para garantir a reprodutibilidade. Utilizar o valor obtido para diluir o material até a concentração desejada em solução salina de inoculo, como descrito abaixo. Para a inoculação, a quantidade de pneumococos no inoculo é calculada antes e depois da inoculação. Esta quantificação de bactérias pelo método de M & M é utilizado para determinar o número médio de pneumococos no inoculo que representa o tempo que leva a completar todo o procedimento. Preparar um inoculo, a diluição até à concentração desejada e realizar a quantificação pelo método de M & M para o "pré-inoculação" count. No nosso Centro de Pesquisa Clínica que leva a equipe de 30 minutos para completar o processo de inoculação inteiro. Pneumococcal suspensões em soro fisiológico normalmente irá mostrar uma contagem diminuída neste intervalo. Para ter em conta isto, nós Deixe o inóculo diluído à temperatura ambiente durante 30 min e, em seguida, executar uma "pós-inoculação" quantificação das bactérias pelo método de M & M. Tomar a média do antes e depois de determinar a concentração final inoculado. Ajuste a "sessão" tempo de acordo com o protocolo clínico, mas manter o intervalo tão breve quanto possível. Todos os novos lotes deve ser enviado para um laboratório de referência para a confirmação da pureza e identidade de estoque. 3. Preparação do inóculo Preparação do inoculo deve começar antes de 30 min o agendamento voluntário inoculação. Pegue um dos tubos de ações feitas anteriormente fora do congelador -80 ° C, descongele-o e girar o tubo na microcentrífuga a 17.000 xg por 3 min. Placas de agar de sangue quente na incubadora a 37 ° C. Prepararuma placa de 96 cavidades para a quantificação de bactérias pelo método de M & M e preparar tubos de diluição de acordo com a dose desejada. Remover o sobrenadante do caldo de tubo centrifugado e ressuspender o pellet em 1 ml de solução salina. Este passo remove o caldo do inóculo. Repetir o passo de centrifugação. Remover o sobrenadante salina e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução salina. Executar conjunto de diluição para a concentração desejada de inóculo e quantificar por M & M método. Leve o inóculo para o compromisso voluntário e após a inoculação dos voluntários, repita a quantificação no laboratório. Rotular o tubo com a data e a dose de inoculo e armazenar a -80 ° C. Para garantir a consistência da inoculação para a inoculação, é importante usar as mesmas pipetas e equipamento de laboratório dedicado a cada vez. 4. Inoculação Os voluntários devem estar sentado confortavelmente em uma posição semi-deitada. <li> Com uma pipeta P200 e estéreis pontas com filtro elaborar 100 ul do inóculo e insira a ponta dentro da cavidade nasal. Lentamente expelir o inoculo para a mucosa nasal, usando um movimento circular. É fundamental que a ponta da pipeta não entra em contacto com a mucosa nasal, como uma interrupção na integridade do epitélio pode resultar em que as bactérias que entram na corrente sanguínea. É também vital que o inóculo não é colocado muito para trás, ou ele vai correr pela garganta, que devem residir no interior da cavidade nasal. Repita a operação para o outro naris. Têm o voluntário permanecer na posição de semi-deitada durante 10 min sem cheirar ou assoar o nariz. Isto permite o tempo para as bactérias se dispersar através da mucosa. 5. Monitoramento Os voluntários são monitorados diariamente após inoculação. Isso inclui uma mensagem de texto enviado diariamente pelo voluntário para investigadores antes de 2 horas. Se o texto inão é recebido por duas horas o voluntário será contactado para garantir a sua / o seu bem-estar. Se ele / ela não responder, o próximo alocado de parentes será contactado para garantir o voluntário do bem-estar. Voluntários são convidados a relatar quaisquer sintomas do trato respiratório superior, a cada nomeação. Corpo clínico vai pedir ao voluntário para descrever suas / seus sintomas e irá acompanhar quaisquer queixas. Os antibióticos dadas aos voluntários são só deve ser tomada em três circunstâncias: no caso de que eles estão bem e são orientados a levá-los pela equipe de pesquisa, se eles estão carregando pneumococo no final do estudo, ou se eles são mal e não conseguiu contatar a equipe de pesquisa. O voluntário é encorajado a manter este pacote de emergência com eles em todos os momentos durante o estudo e é contactar a equipe de pesquisa em uma base diária para os próximos 7 dias. Nossa equipe está disponível 24/7 com o contato enfermeira durante as horas de trabalho e dois médicos disponíveis de hours. Todas as consultas são tratados por chamada telefónica e / ou revisão imediata. Provisões estão disponíveis para admissão imediata e direta a uma ala de Doenças Infecciosas, se necessário. 6. Nasal Wash (NW) Procedimento Lavagens nasais (NW) são realizados a uma visita de rastreio inicial, bem como 48 horas, 7 e 14 dias pós-inoculação. O método utilizado é tomado NW de Naclerio et al. Oito voluntários naturalmente colonizado por S. pneumoniae são excluídos da inoculação e acompanhamento. O voluntário está sentado confortavelmente ea cabeça inclinada para trás 30 ° com a vertical. Peça ao voluntário para tomar uma respiração profunda e segurar a respiração enquanto empurrando a sua língua para cima e para trás, contra o céu da boca. Enquanto nessa posição, o voluntário é convidado a indicar que eles estão prontos. A seringa cheia com 20 ml de solução salina é inserido no espaço nasal anterior e 5 ml de solução salina é expelido. O volunteer então se inclina para frente imediatamente e expulsa o fluido por exalar rapidamente através de seu nariz em uma bacia de alumínio. Repetir este procedimento 3 vezes mais, de modo que cada naris foi lavado duas vezes e os 20 ml cheio tiver sido utilizado. Piscina de todas as amostras em conjunto num tubo de centrífuga e envie para o laboratório à temperatura ambiente durante o processamento. 7. Nasal Wash Processamento Centrifugar as amostras durante 10 min a 3.345 x g. Remover o sobrenadante e armazenada como alíquotas de 1 ml em tubos Eppendorf marcados à temperatura de -80 ° C. Adicionam-se 100 ul de meio STGG 9 do pellet e misture bem. Certifique-se de que o volume total dentro do tubo neste ponto é determinado. Esta diluição será usada para calcular o CFU de uma carruagem NW positivo. Placa de queda de 20 ul da STGG contendo o sedimento ressuspenso para uma placa de agar de sangue contendo gentamicina e raia a placa inteira. Se o NW é pós-inoculação, 10 ul de remover o STGG contendo o sedimento ressuspenso e utilização para a quantificação de bactérias por M & M método. Adicione mais 800 ul de STGG ao tubo NW e misture bem. Ul placa 25 sobre uma placa de agar de sangue e de 25 ul numa placa de ágar de chocolate, listando a placa inteira. Dividir as bactérias em suspensão numa quantidade restante STGG médio em 2 criotubos e armazenar a -80 ° C. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite em 5% de CO 2. Examine as placas no dia seguinte para pneumococo e outros patógenos respiratórios potenciais. Os pneumococos são identificados em placas por meio da morfologia de colónias. Colónias hemolíticas com morfologia alfa relator são sub-cultivadas em agar de sangue, com um disco de optoquina e incubadas durante a noite. Presumíveis colónias de pneumococos que são optoquina sensíveis são Gram para confirmar diplococos Gram positiva e sorotipadas usando o Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.