人体实验肺炎球菌运输

1。志愿者选拔和筛选健康志愿者招募海报广告和大学的网站上，根据NHS研究伦理委员会的指导。 参与的入选标准是： 年龄在18-60岁的成人。 能说一口流利的英语，并能很容易沟通，移动电话和短信。 参与的排除标准是： 亲密接触风险的个人（儿童，免疫抑制的成年人，老年人，慢性疾病）。 目前吸烟者或显着的吸烟史（> 10包年）。 哮喘或其他呼吸系统疾病。 妊娠。 对青霉素或阿莫西林过敏。 另外的临床试验，除非观察或在非介入相电流参与。 无法给予充分的知情同意。 初步筛选的访问，大约一个星期前接种，包括一个中心的临床病史和有针对性的临床检查。 如果发现了先前未知的异常，志愿者将被排除在研究之外，并会安排适当的调查，通过初级保健。 在初步筛选获得，以确保白细胞计数在正常范围内的接种访问前，访问全血计数。一个洗鼻，排除自然肺炎球菌携带者（见6.1）。 在接种前，志愿者们参与这项研究涉及的风险教育，和提供急诊病人传单，数字温度计，紧急电话号码和3天的课程阿莫西林。 2。制备接种股份的接种股，在一个干净的环境中，必须做的下游。用移液管只应使用d为接种物的制备。所有的玻璃和塑料制品应是无菌的。我们建议准备接种股票在一个专门的房间，使用专用通风柜和孵化器。 肺炎球菌菌株接种到血琼脂平板上。板在37℃下温育，在5％CO 2晚 。以下所有天的细菌是从血琼脂平板上刮下，并接种到胎圈的库存中保存系统。这些珠库存用于接种备料的。测试前准备接种股票珠为污染和菌落均匀性的股票。 要准备接种股票，接种于血琼脂平板上的两颗珠子所需的肺炎球菌血清型珠股票，裸奔，以覆盖整个板。温育平板在37℃下在5％CO 2的过夜。所有进一步的的孵育将使用这些相同的条件下。同时孵化的Vegitone的过夜，以保证无菌的媒体。 第二天早上拭子板的一半，小心不要删除任何血琼脂，和添加12毫升预热的Vegitone肉汤。重复使用的板的另一半。保留这两个12毫升小瓶在37°C，2小时或，直到浊度的变化变得明显，以先到者为准。 加入12毫升〜40毫升预热的Vegitone肉汤调匀。重复的其他12毫升小瓶。这是时间点= 0。取出100微升，在600nm处读取光密度（OD）。取出20微升为量化的细菌菌落形成单位（CFU）的使用的方法的变化的计数由Miles和Misra（M＆M）7。孵育两个小瓶。 对于M＆M，把一个血琼脂平板上分为六个部分。加入180微升无菌PBS六个孔中的96孔板（U形底）。加入20μl的培养液的顶部以及和组合。串行1:10稀释样品的6倍，从第六的好丢弃20μL。将三个从顶部以及到首节的10微升滴血琼脂平板上。其他五个井重复上述步骤。确保板是干之前，反转和培养。 第二天可见的菌落数一数部分，并记录每个稀释度。使用的稀释部30和300之间的一个计数，由三个可见的菌落数除以得到一个平均值。 乘以稀释因子的平均数量的菌落，然后除以10（的量的10微升降）。这使CFU /μL。 这个数字乘以1000 CFU /毫升得到。 M＆M方法每隔一小时，直到进行OD 600的读数和定量的细菌月中上旬对数期，外径为0.25。 一旦达到这个OD，加灭菌的10％甘油，并准备一小瓶1毫升等分。将等分试样储存于-80℃。 对于更浓缩的库存中，离心处理，以使其他的小瓶在3,345 xg离心15分钟，除去上清液。重悬在22.5毫升Vegiton的球团E培养基，并添加10％的甘油。准备1毫升等分并存储在-80℃下将股票在-80°C至少48小时前解冻和量化。 量化冷冻细菌股票的M＆M方法。单独测试三种股票的管，以确保重现性。使用稀释股票所需的接种物在生理盐水中的浓度，（如下文所述）所获得的值。 对于接种，肺炎双球菌的数量在接种前和接种后的计算。这种定量细菌由M＆M的方法的是，用于确定肺炎球菌的接种物占所花费的时间来完成整个过程的平均数目。 准备接种物，稀释到所需的浓度，并执行定量分析由M＆M为“预接种”的计数的方法。 在我们的临床研究设施，它需要团队30分钟就完成了整个接种程序。净光合速率eumococcal悬浮在生理盐水中，通常会显示在此区间内下降计数。考虑到这一点，我们让稀释后接种在室温下放置30分钟，然后执行“量化的细菌接种后的M＆M方法。 的前，后取平均，以确定最终的接种浓度。调整“坐”的时间根据您的临床试验方案，但保持的时间间隔尽量简短。 所有新的股票，应送到参考实验室进行确认股票的纯度和特性。 3。接种物的制备制备的接种计划的志愿者接种任命开始前30分钟。 拿一个以前的库存管在-80℃的冰箱中，解冻和旋转的微量离心管中，17,000×g离心3分钟。 温血琼脂平板上，在37℃培养箱中培养。准备在96孔板上进行细菌定量由M＆M的方法和制备稀释管，根据所要求的剂量。 移除肉汤从离心管的上清液，将沉淀重悬于1毫升的生理盐水。此步骤将删除从接种肉汤。 重复离心步骤。 移除生理盐水的上清液，将沉淀重悬于1毫升的生理盐水。 所需的接种浓度进行稀释组和量化的M＆M方法。 以接种的志愿任命的，接种后的志愿者，在实验室重复的量化。标记管与日期和接种剂量并存储在-80℃下从接种到接种，以确保一致性，重要的是使用相同的移液管和专用实验室设备每次。 4。接种志愿者应舒适地坐在一个半卧位。 <li使用P200移液器和无菌过滤嘴的100微升的接种和尖端插入鼻腔内。 慢慢地驱逐接种到鼻黏膜的圆周运动。 这是非常重要的，吸头不接触的鼻黏膜上皮细胞的完整性中断，可能会导致细菌进入血液循环。 同样重要的是接种太靠后放置，否则将跑下来的喉咙，它应位于鼻腔内。 重复的其他鼻孔。 让志愿者保持半卧位10分钟无嗅或擤鼻。这让整个黏膜的细菌分散时间。 5。监控志愿者们每天监测接种。这包括一个由志愿者每天发来的短信，到下午2点之前的调查。 如果文本我不是下午2时收到的志愿者将进行联络，确保他/她的幸福。如果他/她不回答，所分配的近亲联系，以确保志愿者的幸福。 志愿者被要求报告任何上呼吸道症状，在每一个预约。临床工作人员会问志愿者来形容他/她的症状和会跟进任何投诉。 抗生素的志愿者只有在三种情况下应采取的事件，他们感到不适，并且被要求把他们的研究团队，如果他们携带肺炎球菌在研究结束时，或如果他们感到不适无法联系的研究团队。志愿者是鼓励他们在任何时候都在研究过程中保持这种应急包，并在未来7天每天被要求联系的研究团队。 我们的团队提供24/7在工作时间内与护士接触和两名医生的豪“市区重建策略”。所有的查询都通过电话和/或直接审查处理。规定是，如果需要，可以立即，直接进入传染病病房。 6。洗鼻器（NW）程序鼻洗液（NW）进行初步筛选的访问，以及48小时，7，和14天接种后。 NW方法是采取8从Naclerio 等。的志愿者自然殖民由S.被排除在接种肺炎和跟进。 志愿者落座舒适和头部倾斜时，从垂直方向30°。 要求志愿者深吸了一口气，屏住呼吸，同时把自己的舌头向上和向后反口的屋顶。虽然在这个位置上，志愿者被要求，以表示他们已经准备好。 填充用20ml生理盐水的注射器插入到鼻前空间和5 ml生理盐水被逐出。该volunteer，则立即向前倾，并迅速通过自己的鼻子呼气，铝箔碗，排出的液体。 此过程重复3次以上，使每个鼻孔已洗涤两次，并已被用于完整的20毫升。 游泳池所有样品一起在离心管中，并在室温的温度进行处理，发送到实验室。 7。洗鼻器处理 10分钟，3,345×g下离心样品。 除去上清液并存储标记的Eppendorf管中为1毫升的等分试样在-80℃下加入100μl的STGG的颗粒介质9调匀。确保被确定，在这一点上在管中的总体积。这的稀释将用于计算CFU马车正NW。 板的STGG到血琼脂平板上含有庆大霉素和条纹，整个板块的再悬浮颗粒的20微升下降的。 如果NW接种后，取出10μL从的STGG再悬浮颗粒和使用细菌定量的M＆M方法。 加入800μl的STGG西北管调匀。 板25微升到血琼脂平板和25μl一个巧克力琼脂平板上，裸奔，整个板块。 除以剩余量细菌悬浮在STGG 2冷冻管和存储介质进入在-80℃下孵育板在5％CO 2中在37℃培养过夜。 检查板的第二天，肺炎球菌和其他潜在的呼吸系统病原体。 肺炎球菌确定平板上菌落形态。阿尔法溶血的菌落草拟专员形态子培养到血液琼脂与一个奥普托欣的光盘和孵育过夜。 推定奥普托欣敏感的肺炎球菌菌落，革兰氏染色确认革兰氏阳性球菌血清型的Statens血清研究所肺炎motest乳胶试剂盒。