Carriage Experimental neumocócica Humanos

1. Voluntarios de Selección y Evaluación Los voluntarios sanos son reclutados a través de anuncios y carteles en la web de la Universidad de acuerdo con la investigación del NHS y la orientación del Comité de Ética. Los criterios de inclusión para la participación son: Los adultos de 18-60 años. Habla con fluidez Inglés y es capaz de comunicarse con facilidad tanto por teléfono móvil y mensajes de texto. Los criterios de exclusión de participación son las siguientes: El contacto estrecho con individuos en riesgo (niños, adultos inmunosuprimidos, la salud ancianos, enfermos crónicos). Actual fumador o significativa historia de tabaquismo (> 10 paquetes). El asma u otras enfermedades respiratorias. Embarazo. La alergia a la penicilina o amoxicilina. Participación actual en otro ensayo clínico observacional o menos en la no-intervencionista fase. Incapaz de dar un consentimiento plenamente informado. Una visita de selección inicial, aproximadamente una semana antes de la inoculación, incluye una historia clínica y exploración enfocada clínicas específicas. Si previamente no reconocido se encuentra algo anormal, el voluntario será excluido del estudio y la investigación correspondiente se organizarán a través de la atención primaria. Durante el cribado inicial visitar un conteo sanguíneo completo se obtiene para asegurar que el recuento de glóbulos blancos está dentro del rango normal antes de la visita de la inoculación. Un lavado nasal se realiza para excluir portadores naturales de neumococo (ver 6.1). Antes de la inoculación, los voluntarios están educados sobre los riesgos que implica la participación en el estudio y se les proporciona un prospecto de emergencia, termómetro digital, teléfonos de emergencia y 3 días de curso de la amoxicilina. 2. Preparación de las poblaciones de inoculación Preparación de las poblaciones de inoculación debe realizarse en un ambiente limpio. Las pipetas usadas sólo se deben utilizard para la preparación del inóculo. Todo el vidrio y artículos de plástico deben ser estériles. Se recomienda que las poblaciones de inoculación se preparó en una sala específica, utilizando una campana de humos y dedicado incubadora. Cepas neumocócicas se inocularon en una placa de agar sangre. Las placas se incubaron a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche. El día después de que todas las bacterias se rasparon de la placa de agar sangre y se inocularon en un sistema de stock preservación talón. Se trata de poblaciones de cuentas se utilizan para la preparación de la inoculación de valores. Prueba de los stocks de perlas para la contaminación y la uniformidad colonia antes de preparar un stock de inoculación. Para preparar el stock de la inoculación, inocular una placa de agar sangre con dos talones de la serotipo deseado Imágenes neumocócica talón, en estrías para cubrir toda la placa. Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche. Todas las incubaciones posteriores se utilizan estas mismas condiciones. También se incuban los medios de comunicación Vegitone durante la noche para garantizar la esterilidad. El hisopo mañana siguientela mitad de la placa, no teniendo cuidado de eliminar cualquier agar sangre, y añadir a 12 ml de caldo Vegitone pre-calentado. Repita con la otra mitad de la placa. Agregar los dos viales de 12 ml a 37 ° C durante 2 horas o hasta que un cambio en la turbidez se hace evidente, lo que ocurra primero. Añadir los 12 ml a 40 ml de caldo Vegitone pre-calentado y mezclar bien. Repita para el otro 12 ml frasco. Este es el punto de tiempo = 0. Eliminar 100 l para leer la densidad óptica (DO) a 600 nm. Eliminar 20 l para la cuantificación de las bacterias a la unidad formadora de colonias (CFU) recuento utilizando una variación del método de Miles y Misra (M & M) 7. Incubar ambos viales. Para el M & M, dividir una placa de agar sangre en seis secciones. Añadir 180 l de PBS estéril a seis pocillos de una placa de 96 pocillos (de fondo en U). Añadir 20 l de caldo a la parte superior del pozo y mezclar. Diluciones seriadas de las muestras 1:10 en seis ocasiones y descartar 20 l del pozo sexto. Coloque tres gotas 10 mu l de la parte superior del pozo en la sección primera de laplaca de agar sangre. Repita el procedimiento para los cinco otros pozos. Asegúrese de que la placa está seca antes de que se invirtieron y se incubaron. Al día siguiente, contar el número de colonias visibles en cada sección de dilución y el registro. Usando la sección de dilución con un recuento de entre 30 y 300, se divide el número de colonias visibles por tres para obtener una media. Multiplicar el número medio de colonias por el factor de dilución y se divide por 10 (la cantidad de la caída de 10 l). Esto da UFC / l. Multiplique este número por 1.000 para obtener UFC / ml. Realizar lecturas de DO 600 y cuantificación de bacterias por M & M método cada hora hasta principios de fase semilogarítmica se alcanza una DO de 0,25. Una vez que se alcanza este OD, añadir glicerol esterilizado 10% a un vial y preparar alícuotas de 1 ml. Tienda de alícuotas a -80 ° C. Para una acción más concentrada, centrifugar el otro vial en 3.345 xg durante 15 min y separar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 22,5 ml de Vegitone medio y agregar 10% de glicerol. Preparar alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 ° C. Deja existencias a -80 ° C durante al menos 48 horas antes de descongelar y cuantificar. Cuantificar la población bacteriana congelado por el método M & M. Pon a prueba tres tubos de valores de forma individual para asegurar la reproducibilidad. Utilizar el valor obtenido para diluir la acción a la concentración de inóculo deseada en solución salina, como se describe a continuación. Para la inoculación, la cantidad de neumococos en el inóculo es calculado antes y después de la inoculación. Esta cuantificación de bacterias por el método de M & M se utiliza para determinar el número medio de neumococos en el inóculo que representa el tiempo que tarda en completar todo el procedimiento. Preparar un inóculo, diluir a la concentración deseada, y llevar a cabo la cuantificación por el método de M & M para el "pre-inoculación" recuento. En nuestro Centro de Investigación Clínica que tarda el equipo de 30 minutos para completar el procedimiento de inoculación entero. Pneumococcal suspensiones en solución salina por lo general muestran una disminución en el recuento en este intervalo. Para dar cuenta de esto, deje encendido el inóculo diluido a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego realizar una "post-inoculación" cuantificación de las bacterias por el método M & M. Tomar el promedio de la antes y después para determinar la concentración final inoculado. Ajuste el "sentadas" tiempo de acuerdo con el protocolo clínico, pero mantener el intervalo tan breve como sea posible. Todos los stocks nuevos deben enviarse a un laboratorio de referencia para la confirmación de la pureza y la identidad de stock. 3. Preparación del inóculo Preparación del inóculo debe comenzar 30 min antes de la cita programada voluntario inoculación. Tomar una de las trompas de valores previamente hechas de la -80 ° C congelador, se descongela y gire el tubo en la microcentrífuga a 17.000 xg durante 3 min. Warm placas de agar sangre en la incubadora a 37 ° C. Prepararuna placa de 96 pocillos para la cuantificación bacteriana por el método de M & M y preparar los tubos de dilución de acuerdo con la dosis deseada. Quitar el sobrenadante del tubo de caldo centrifugado y resuspender el sedimento en 1 ml de solución salina. Este paso elimina el caldo del inóculo. Repetir el paso de centrifugación. Eliminar el sobrenadante salina y resuspender el sedimento en 1 ml de solución salina. Realizar conjunto dilución de la concentración de inóculo deseado y cuantificar por M & M método. Tome el inóculo para la designación voluntaria y después de la inoculación de los voluntarios, repita la cuantificación en el laboratorio. Marque el tubo con la fecha y la dosis de inóculo y se almacena a -80 ° C. Para garantizar la coherencia de la inoculación de la inoculación, es importante utilizar las mismas pipetas y equipo de laboratorio dedicado cada vez. 4. Inoculación Los voluntarios deben estar sentados cómodamente en una posición semi-reclinada. <li> Con una pipeta estéril P200 y puntas con filtro elaborar 100 l de inóculo e inserte la punta justo en el interior de la cavidad nasal. Lentamente expulsar el inóculo en la mucosa nasal con un movimiento circular. Es crucial que la punta de la pipeta no entre en contacto con la mucosa nasal como una interrupción en la integridad del epitelio podría resultar en las bacterias que entran en el torrente sanguíneo. También es vital que el inóculo no está demasiado lejos o se ejecutará en la garganta, sino que debe residir en el interior de la cavidad nasal. Repita para el otro naris. Haga que el voluntario permanezca en la posición semi-sentado por 10 minutos sin aspirar o soplar por la nariz. Esto permite tiempo para que las bacterias se dispersan a través de la mucosa. 5. Monitoreo Los voluntarios son supervisados ​​diariamente después de la inoculación. Esto incluye un mensaje de texto enviado por el diario voluntario a los investigadores antes de las 2 pm. Si el texto is no ha recibido de las 2 pm el voluntario será contactado para asegurar su / su bienestar. Si él / ella no responde, el próximo asignado familiares serán contactados para asegurar el voluntario de bienestar. Los voluntarios se les pidió que informaran sobre cualquier síntomas del tracto respiratorio superior en cada cita. El personal clínico le pedirá al voluntario para describir sus / sus síntomas y realizará un seguimiento de las denuncias. Los antibióticos administrados a los voluntarios sólo deben tomarse bajo tres circunstancias: en caso de que no se sienten bien y tienen instrucciones de llevarlos por el equipo de investigación, si llevan neumococo al final del estudio, o si no se sienten bien y no puede comunicarse con el equipo de investigación. El voluntario se le anima a mantener este paquete de emergencia con ellos en todo momento durante el estudio y está en contacto con el equipo de investigación sobre una base diaria para los próximos 7 días. Nuestro equipo está disponible 24/7 con contactos enfermera durante las horas de trabajo y disponibles dos médicos de hours. Todas las consultas son atendidas por llamada telefónica y / o revisión inmediata. Las disposiciones están disponibles para la admisión inmediata y directa a una sala de Enfermedades Infecciosas, si es necesario. 6. Nasal Wash (NW) Procedimiento Los lavados nasales (NW) se realizan a una visita de cribado inicial, así como de 48 hr, 7, y 14 días después de la inoculación. El método utilizado NW se toma de Naclerio et al. 8 Voluntarios naturalmente colonizados por S. pneumoniae se excluyen de la inoculación y seguimiento. El voluntario se sienta cómodamente y la cabeza inclinada hacia atrás 30 ° respecto a la vertical. Pida al voluntario que tomar una respiración profunda y aguantar la respiración mientras empuja la lengua hacia arriba y hacia atrás contra el techo de la boca. Mientras en esta posición, el voluntario se le pide a la señal de que están listos. Una jeringa llena con 20 ml de solución salina se inserta en el espacio nasal anterior y 5 ml de solución salina es expulsado. El volunteer luego se inclina hacia adelante inmediatamente y expulsa el líquido exhalando rápidamente por la nariz en un recipiente de aluminio. Repita este procedimiento 3 veces más para que cada fosa nasal ha sido lavadas dos veces y el completo de 20 ml se ha utilizado. Piscina todas las muestras juntas en un tubo de centrífuga y se envía al laboratorio a temperatura ambiente para su procesamiento. 7. Nasal Wash Procesamiento Centrifugar las muestras durante 10 min a 3.345 x g. Eliminar el sobrenadante y almacena como alícuotas de 1 ml en tubos Eppendorf etiquetados a -80 ° C. Añadir 100 l de medio LTGG 9 al sedimento y mezclar bien. Asegúrese de que el volumen total en el tubo en este punto se determina. Esta dilución se utiliza en el cálculo de la UFC de un carro positivo NW. Placa de una caída de 20 l de la LTGG que contiene el sedimento resuspendido en una placa de agar sangre que contiene gentamicina y racha de toda la placa. Si el NO es posterior a la inoculación, Retirar 10 l de la LTGG que contiene el precipitado resuspendido y de uso para la cuantificación de bacterias por M & M método. Añadir otra l 800 de LTGG al tubo NW y mezclar bien. Placa de 25 l en una placa de agar sangre y 25 l en una placa de agar chocolate, rayando la placa entera. Divida la bacteria cantidad restante en suspensión en medio LTGG en 2 crioviales y almacenar a -80 ° C. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche en 5% de CO 2. Examinar las placas al día siguiente por neumococo y otros patógenos respiratorios potenciales. Los neumococos son identificados en las placas de morfología de las colonias. Alpha colonias hemolíticas con morfología ponente se subcultivan en agar sangre con un disco optoquina y se incubaron durante la noche. Presuntos colonias neumocócicas que son sensibles optoquina se tiñen Gram para confirmar diplococos Gram positivos y serotipificación con el Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.