الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد
概要
يصف هذا البروتوكول طريقة فخ الجين إقحامي الطفرات باستخدام GAL4-VP16 كما مراسل الابتدائية وGFP / RFP كما صحفيين الثانوية في الزرد. حوالي واحد من كل عشرة عالية، معربا عن F0 محصول الأسماك الجين فخ ذرية المشترك، معربا عن GFP وطلب تقديم العروض. إجراءات الفحص يمكن زيادتها بسهولة للتكيف مع حجم المختبر أداء الشاشة الطفرات إقحامي.
Abstract
كبير حجم مخلب والتنمية الخارجية الأجنة الزرد شفافة بصريا جعل نظام نموذج الفقاريات استثنائية لفي الجسم الحي باستخدام الطفرات إقحامي للصحفيين الفلورسنت لعلامة التعبير عن الجينات المتحولة. وقد شيدت العديد من المختبرات واختبار ناقلات محسن والجينات فخ في الزرد، وذلك باستخدام البروتينات الفلورية، تفعيل النسخي مقرها LEXA-GAL4 وكما صحفيين 1-7. كان لهذه النواقل اثنين من السلبيات المحتملة: التشدد الأمثل (مثل عدم القدرة على التفريق بين الأحداث محسن والجينات فخ) وطفرات منخفضة (مثل التكامل في الجينات نادرا ما تنتج الأليلات فارغة). وقد وضعت الجينات يكسر ينقول (GBTs) لمعالجة هذه العيوب 8-10. قمنا بتعديل واحدة من ناقلات GBT الأولى، GBT-R15، للاستخدام مع GAL4-VP16 كما مراسل الأولية فخ الجينات وUAS وأضاف: كما EGFP مراسل الثانوية للكشف المباشر للأحداث فخ الجينات. Application من GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي يوفر ميزتين الرئيسية. أولا، لأنه يزيد الحساسية للجينات التي أعرب عنها في مستويات التعبير المنخفض. الثاني، فإنه تمكن الباحثون لاستخدام خطوط فخ الجين كسائقين GAL4 إلى التعبير المباشر عن الجينات المحورة أخرى في أنسجة محددة للغاية. وهذا هو ذات الصلة وخاصة بالنسبة للجينات مع وظائف غير الضرورية أو الزائدة عن الحاجة، حيث قد لا يؤدي فخ الجين التكامل في الظواهر العلني. وسيئات استخدام GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي هو أن الجينات الترميز للبروتينات مع تسلسل إشارة N-محطة ليست قابلة للمحاصرة، وكذلك الناتجة GAL4-VP16 البروتينات الانصهار غير المرجح أن تكون قادرة على الدخول نواة وتفعيل النسخ. الأهم من ذلك، استخدام GAL4-VP16 لا قبل تحديد البروتينات النووية: نحن تعافى الجينات طفرات في الجينات فخ ترميز البروتينات التي تعمل في النواة، السيتوبلازم والغشاء البلازمي.
Introduction
وقد ثبت الطفرات إقحامي ليكون نهجا قوية لتشريح وظيفة الجين في نظم نموذج مختلف الكائنات وحيدة الخلية مثل من البكتيريا والخميرة لالكائنات متعددة الخلايا مثل الفئران والنباتات. أي DNA الخارجية (فيروس، أو ينقول البلازميد) قد تكون بمثابة المغير عن طريق قطع عناصر أساسية من الجينات مثل الإكسونات أو المروجين. الهدف الفعال لهذه النهج بسيطة صغيرة جدا في الجينوم مجمع كبير، منذ تشكل الإكسونات 1-3٪ فقط من الفقاريات الجينوم نموذجية. فعالة صغيرة الحجم المستهدف يمكن التغلب عليها بنسب التكامل ناقلات عالية جدا، كما يتضح من النجاح الهائل من الطفرات إقحامي فيروسات في الزرد 11،12. في المقابل، تشكل الإنترونات حوالي 20-30٪ من الجينوم الفقارية. في الزرد، القائم على ناقلات ينقول الطفرات إقحامي الذي يعرض بشكل فعال فارغة أو الطفرات hypomorphic شديدة على الاندماج في الإنترونات وتمت تسمية "الجين كسر transposoنانوثانية "(GBTs) 8-10. للكفاءة التكامل فخ الجين، فإنها تستخدم الحد الأدنى من Tol2 ينقول 13،14. مسبب للطفرات الجينية من GBTs تعتمد على المشتقة من الأسماك لصق متقبل والنسخي تسلسل إنهاء / تذييل بعديد الأدينيلات. ويحيط العناصر المسؤولة عن طفرات GBT من مواقع loxP المباشر لاستئصال من قبل لجنة المساواة العرقية recombinase. وهكذا، حقن مرنا لجنة المساواة العرقية يؤدي إلى الارتداد كفاءة الطفرات المستحثة GBT، على الرغم من بعض متواليات ينقول تبقى في موضع التكامل 9،10.
ناقلات GBT نشرت مؤخرا استخدام mRFP كما في فخ الجين مراسل 9،10، مما يؤدي إلى اثنين من أوجه القصور المحتملة. الأولى، فإنه لا يعرف ما جزء من الجينات الزرد يتم التعبير على مستوى عال بما فيه الكفاية ليتم الكشف عن طريق الاتصال المباشر الفلورسنت البروتينات مراسل الانصهار. الثانية، ومن المتوقع أن يكون لها وظائف أساسية فقط مجموعة فرعية صغيرة من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن هناك فقط 1،400-2،400 الجينات اللازمة لdevelopme الزردالإقليم الشمالي 15،16. وليس من المتوقع لعرض الظواهر العلني، وبالتالي سيكون لها فائدة محدودة معظم فخ الجين المسوخ. للتغلب على هذه القيود اثنين، ونحن قد عدلت GBT-R15 9،10 للاستخدام مع GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي (Balciuniene آخرون قيد الإعداد). كما هو الحال مع AUG-أقل mRFP في GBT-R15، تمت إزالة الموقع بداية الترجمة من GAL4-VP16. للكشف المباشر للأحداث فخ الجينات، ناقلات لدينا تحتوي على مراسل EGFP تحت سيطرة 14X GAL4 UAS 17،18.
صممت العديد من الميزات الإضافية لدينا في ثنائية فخ الجين ناقلات. وUAS: ويحيط EGFP الكاسيت من مواقع FRT المباشر (الاقتباس الرمادي في الشكل 1). حقن FLP recombinase مرنا يؤدي إلى استئصال UAS: EGFP الكاسيت، وترك تحور الجين فخ يشبها EGFP مضان. ويمكن عندئذ أن تستخدم في خطوط المعدلة وراثيا والتي بمناسبة أنسجة معينة أو أحداث التنموية التي كتبها GFP مضان. كما هو الحال في غيرهاGBTs، ويحيط كله فخ الجين الكاسيت من مواقع loxP المباشر (خماسي مفتوحة في الشكل 1). وهذا يجعل الأحداث فخ الجين عكسها من خلال التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase، وإنشاء بسهولة إثبات العلاقة السببية بين فخ الجين التكامل محددة، ولاحظ النمط الظاهري (الشكل 2). أخيرا، ويحيط فخ الجين الكاسيت من مواقع meganuclease I-SCEI مقلوب (مثلثات سوداء في الشكل 1). في ذبابة الفاكهة، وغالبا ما يتم تحويلها إلى التكامل ينقول الحذف (القصور) من خلال الاستئصال غير دقيقة من العنصر P. لا يوجد أي دليل على أن الختان من Tol2 ينقول (أو أي ينقول الأخرى العاملة في الفقاريات مثل الجمال النائم، PiggyBac أو التيار المتردد / التاءات) يمكن أن يؤدي إلى الحذف. لذا أدرجنا مواقع I-SCEI كوسيلة بديلة محتملة للتحريض والحذف، على الرغم من أنه لا يوجد دليل على أن SCEI I-يمكن أن تحدث الحذف في الزرد. تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن SCEI I-الضخمةيمكن استخدامها لتسهيل نقل الجينات نوكلياز في الزرد، ويستخدم الانقسام الحمض النووي عن طريق I-SCEI meganuclease لدراسة آليات إصلاح الحمض النووي، بما في ذلك نهاية غير المتجانسة الانضمام عرضة للخطأ، في الخميرة وخلايا الثدييات 19-22.
التكامل لدينا فخ الجين ناقلات يمكن أن يؤدي إلى EGFP التعبير من خلال آليتين مختلفتين. الأول هو صحيح فخ الجين الحدث (الشكل 1C): ناقلات يدمج الجين (IMG لتحور الجينات Insertionally)، نسخة الانصهار بين 5 'من محضر IMG الذاتية وGAL4-VP16 يرصد ويترجم إلى انصهار بروتين تحتوي على N-محطة من البروتين المشفرة بواسطة وIMG GAL4-VP16. هذا البروتين الانصهار بربط UAS 14X وينشط النسخ من EGFP. الثانية، الحدث اقل من المرغوب فيه هو فخ محسن (الشكل 1D): المروج الحد الأدنى من أمام EGFP يقع تحت سيطرة محسن بالقرب من موقع التكامل، مما يؤدي إلى إنتاج EGFP في أساسهاالعمالي الإنتاج GAL4-VP16. في تقديرنا، 30-50٪ من الأحداث التعبير EGFP هي نتيجة لاعتراض محسن وترجع إلى فخ الجين 23٪ 50-70 (Balciuniene آخرون قيد الإعداد). للتمييز بين هاتين الفئتين من الأحداث، حققنا 14xUAS: mRFP خط المعدلة وراثيا (الشكل 1B)، للراحة تميزت عدسة محددة γCry: (. Balciuniene آخرون قيد الإعداد) GFP. يتم التحقق من الأحداث فخ الجين عن طريق المشاركة في التعبير عن GFP وطلب تقديم العروض (قارن C و D في الشكل 2).
في الشاشة التجريبية لدينا، ونحن تعافى أكثر من 40 فخ الجين الأحداث بعد فحص 270 الأسماك F0 حقن بمزيج من الحمض النووي ينقول وtransposase مرنا. حدثت اثنين من الجينات لدينا فخ التكامل في الجينات مع سبق نشرها المسوخ التي يسببها كيميائيا: جبهة الخلاص الوطني وطنين خط المجال المغنطيسي. الظواهر لدينا المسوخ إقحامي tpl6 جبهة الخلاص الوطني وFLR tpl24 لا يمكن تمييزها بشكل سطحي من النمط الظاهريق من المقابلة المسوخ التي يسببها كيميائيا. لاحظنا أيضا أن أحداث فخ الجينات تظهر منحازة نحو الإنترونات قرب نهاية 5 'من الجينات، وبالتالي زيادة احتمال الأليلات فارغة. نفعل مراقبة درجة معينة من UAS إسكات (تلون) في كل من خطوط فخ الجينات، وبعض مواضع من الواضح أكثر عرضة للتلون من غيرها. نحن لا نعتقد أن UAS إسكات مشكلة كبيرة لانتشار خطوط فخ الجين، كما كنا قادرين على نشر بسهولة كل من خطوط فخ الجينات من خلال خمسة أجيال على الأقل عن طريق اختيار لGFP التعبير وحدها.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويجري بالفعل استخدام ناقلات فخ الجينات والمنهجية الموضحة هنا في عدة مختبرات مستقلة. في تجربتنا، وهناك نوعان من الخطوات الحاسمة في هذه العملية. الخطوة الحاسمة الأولى لتحقيق معدلات عالية من فخ الجينات في الأجنة التكامل F0 حقن. يمكن في كثير من الأحيان أن يعزى الفشل في هذه الخطوة إلى تلوث ريبونوكلياز من الكواشف الحقن، وخاصة الحمض النووي miniprep. بل هو أيضا مهم جدا لحقن الأجنة في مرحلة 1 خلية لفخ الجين التجارب. في تجربتنا، ونقل الجينات Tol2 بوساطة فعالة جدا، مما يجعل من الممكن الحصول على خطوط المعدلة وراثيا حتى عندما حقن في وقت لاحق من المرحلة 1 الخلية أو الحمض النووي مع أقل جودة. الحقن هي دون المستوى المطلوب أكثر تعقيدا من ذلك بكثير عند إجراء فخ الجينات الطفرات، لأن سوى جزء صغير من التكامل ناقلات يؤدي إلى الأحداث فعالة فخ الجينات. الخطوة الحاسمة الثانية هي للتأكد من فخ الأحداث الجين عن طريق عبور لدينا UAS: خط mRFP. غياب mRFP التعبيردائما تقريبا مما يشير إلى حدوث الحدث فخ محسن. ومع ذلك، وأحيانا عدم وجود mRFP التعبير قد يشير إلى إسكات UAS 14X. ولذا فمن المهم للحفاظ على UAS: خط mRFP في حالة غير أسكتهما نشر الجيل المقبل باستخدام الأفراد مع طلب تقديم العروض عالية التعبير عندما عبرت لtpl6 جبهة الخلاص الوطني.
يمكننا أن نتوقع اتخاذ العديد من التحسينات لدينا فخ الجين ناقلات والبروتوكول. الأول هو استخدام UAS أقل تكرارا في فخ الجينات بناء. فقد تبين أن 5X UAS كافية لتحقيق التفعيل الكامل في تجارب زراعة الخلايا، والتي متواليات UAS أقل تكرارا هي أقل عرضة للمثيلة وإسكات 6،25. قد يكون من الممكن أيضا لتصميم مصيدة الجين ناقلات للالطفرات مشروطة تماما، تشبيها له النواقل المستخدمة من قبل الماوس الدولي فخ الجين كونسورتيوم مؤخرا وتكييفها لالزرد 2،26،27. سوف تحسن آخر يتمثل في استخدام ر مختلفةنظام ransposon، على سبيل المثال الجمال النائم 28، لتوليد UAS: mRFP خط مراسل. وهذا من شأنه تمكين حقن الجينات الفخاخ مقرها Tol2 مباشرة في خط مراسل والفرز من قبل F0s incrossing. وعلاوة على ذلك، فإن هذا القضاء على استخدام اثنين من خلفيات وراثية مختلفة، مما يجعل تفسير الظواهر فقدان وظيفة أكثر وضوحا. حتى مع هذه التحسينات، فإن العام GAL4 فخ الجين بروتوكول المعروضة هنا لا تزال مطبقة تطبيقا كاملا.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة جنيفر Emtage لقراءة نقدية للمخطوطة، ريان جيل للحصول على المساعدة الفنية والمساعدة في رعاية الزرد والدكتور ستيفن C. Ekker (مايو كلينيك، Rochster، مينيسوتا) للمواد. وقد تم دعم عملنا معبد كلية جامعة العلوم والتكنولوجيا والمعاهد الوطنية للصحة (R01-HD061749).
Materials
| Name of the Reagent/Material | Company | Catalog # | コメント |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
| XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
| mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
| Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
| Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
| Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
| * We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. |
参考文献
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Trinh le, A., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Emelyanov, A., Parinov, S. Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish. Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).
- Ellingsen, S., et al. Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome. Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).
- Sivasubbu, S., et al. Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development. Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).
- Clark, K. J., et al. In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome. Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).
- Petzold, A. M., et al. Nicotine response genetics in the zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).
- Balciunas, D., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. 遺伝学. 174 (2), 639-649 (2006).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).
- Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
- Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).
- Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells. Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).
- Petzold, A. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
- Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish. Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).
- Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).
