Этот протокол описывает метод генной ловушки инсерционного мутагенеза с использованием Gal4-VP16 в качестве основного репортера и GFP / RFP качестве вторичного журналистами в рыбок данио. Примерно один из десяти высокого выражения F0 гена выход рыбы ловушки потомство коэкспрессирующей GFP и RFP. Процедура скрининга могут быть легко масштабируется для адаптации к размеру лабораторией, проводящей инсерционного мутагенеза экран.
Большой размер сцепления и внешний развитие оптически прозрачных эмбрионах сделать данио исключительную позвоночных модельную систему для инсерционного мутагенеза в естественных условиях с использованием флуоресцентных журналистам помечать выражение мутировавших генов. Несколько лабораторий изготовлены и испытаны энхансерные-и ген-ловушки векторы у рыбок данио, используя флуоресцентные белки, Gal4-и Лекса основе активаторы транскрипции как репортеров 1-7. Эти векторы было два потенциальных недостатка: субоптимальный строгость (например, отсутствие способности различать энхансерных-и ген-ловушки событий) и низкой мутагенность (например, интеграции в генах редко производимых нулевые аллели). Джин Главные транспозонов (ГБЦ) были разработаны для удовлетворения этих недостатков 8-10. Мы модифицировали один из первых векторов ББТ, GBT-R15, для использования с GAL4-VP16 в качестве основного гена-репортера ловушки и добавили UAS: EGFP в качестве вторичного репортера прямого обнаружения генной ловушки событий.РИМЕНЕНИЕ из Gal4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортер предоставляет два основных преимущества. Во-первых, это повышает чувствительность генов, выраженных при низких уровней экспрессии. Во-вторых, это позволяет использовать исследователей генной ловушки линии, как Gal4 драйверов в непосредственной экспрессии трансгенов в других очень специфических тканей. Это особенно актуально для генов с несущественных или избыточных функций, где интеграция гена ловушка не может привести к явных фенотипов. Недостатком использования GAL4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортера в том, что гены, кодирующие белки с сигнальных последовательностей N-концевых не поддаются захвата, так как в результате слитые белки GAL4-VP16, вряд ли будут способны проникать в ядро и активировать транскрипция. Важно отметить, что использование Gal4-VP16 не заранее выбрать для ядерных белков: мы выздоровел генной ловушки мутации в генах, кодирующих белки, которые функционируют в ядре, цитоплазме и мембране.
Инсерционного мутагенеза оказалась мощным подход к рассекает функции генов в различных модельных системах от одноклеточных организмов, таких как бактерии и дрожжи, чтобы многоклеточных организмов, таких как мыши и растений. Любой экзогенный DNA (вирус, транспозона или плазмида) может служить в качестве мутагена, прерывая основные элементы генов, таких как экзонов или промоторов. Эффективная цель таких простых подходов чрезвычайно мала в больших сложных геномов, так как экзоны составляют лишь 1-3% от типичной позвоночных геном. Малый эффективный размер мишени могут быть преодолены очень высокая векторных ставок интеграции, о чем свидетельствует огромный успех ретровирусов инсерционного мутагенеза в данио 11,12. В противоположность этому, интроны включают приблизительно 20-30% геномах позвоночных. У рыбок данио транспозонов основе инсерционных мутагенеза векторов, которые эффективно ввести нуль-или серьезные гипоморфных мутации при интегрировании в интронов были названы "ген нарушая transposoнс "(ГБЦ) 8-10. Для эффективной интеграции ген ловушки, они используют минимальное Tol2 транспозон 13,14. Мутагенность ГБЦ полагается на рыб, полученных сращивания акцептора и транскрипционных последовательностей прекращение / полиаденилирования. Элементы, ответственные за ББТ мутагенность фланкированы на прямых участках LoxP для удаления по Cre рекомбиназы. Таким образом, инъекции Cre мРНК приводит к эффективному реверсии GBT-индуцированных мутаций, хотя некоторые транспозонов последовательности остаются в локусе интеграции 9,10.
Недавно опубликованные векторы ББТ использовать MRFP как ген ловушки репортера 9,10, что приводит к двух потенциальных недостатков. Во-первых, не известно, какая часть данио генов экспрессируются на достаточно высоком уровне, чтобы быть обнаружены путем прямых флуоресцентных белков репортер синтеза. Во-вторых, только небольшое подмножество генов, как ожидается, имеют существенные функции. Было подсчитано, что есть только 1,400-2,400 гены, необходимые для рыбок данио Developmeнт 15,16. Большинство генов ловушки мутанты не ожидается проявляют явных фенотипы и поэтому будет иметь ограниченное применение. Чтобы преодолеть эти два ограничения, мы изменили GBT-R15 9,10 для использования с Gal4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортера (Balciuniene и соавт. В стадии подготовки). Как и АВГ-менее MRFP в ББТ-R15, начало перевод сайта был удален из Gal4-VP16. Для прямого обнаружения гена ловушки событий, наши векторы содержат корреспонденту EGFP под контролем 14x Gal4 БАС 17,18.
Несколько дополнительных функций разработаны в нашей двустороннего вектора генной ловушки. УАС: EGFP кассета в окружении прямых участках FRT (серые стрелки на рисунке 1). Инъекция Flp рекомбиназы мРНК приводит к удалению из БАС: EGFP кассеты, оставив генной ловушки мутацию Снята по флуоресценции EGFP. Затем он может быть использован в трансгенных линий, которые обозначают конкретные ткани или события в развитии от флуоресценции GFP. Как и в другихГБЦ, весь ген ловушка кассета в окружении прямых участках LoxP (открытые пятиугольники на рисунке 1). Это делает ген ловушки события обратимы экспрессией Cre рекомбиназы, легко установить доказательство причинности отношений между определенной интеграции ген ловушки и наблюдается фенотип (рис. 2). Наконец, ген ловушка кассета окружении перевернутых Я-SCEI meganuclease сайтов (черные треугольники на рисунке 1). У дрозофилы транспозонов интеграции часто превращается в удалений (недостатков) по неточной иссечения P элемента. Там нет никаких доказательств, что иссечение Tol2 транспозон (или любой другой транспозон активного у позвоночных, таких как Спящая красавица, PiggyBac или AC / DS) может привести к удалений. Поэтому мы включены I-SCEI сайтов как потенциальной суррогатной метод индукции удалений, хотя нет никаких доказательств, что я-SCEI может вызвать удаление у рыбок данио. Следует отметить, что в то время как I-SCEI мегануклеазы могут быть использованы для облегчения трансгенеза у рыбок данио, расщепление ДНК I-SCEI meganuclease используется для изучения механизмов репарации ДНК, в том числе подверженных ошибкам негомологичными конец присоединения, в дрожжах и клетках млекопитающих 19-22.
Интеграция нашей генной ловушки вектора может привести к выражению EGFP двумя различными механизмами. Первым из них является истинным событием ген ловушка (рис. 1C): вектор интегрируется в геном (IMG для Insertionally мутантный ген), слияние транскриптов между 5 'эндогенного IMG стенограммы и Gal4-VP16 производится и переведены на Слитый белок, содержащий N-конец белка, кодируемого IMG и GAL4-VP16. Это гибридный белок связывается с 14x БАС и активирует транскрипцию EGFP. Второй, менее желательно событие является усилитель ловушка (рис. 1D): минимальный промотор перед EGFP падает под контролем энхансера вблизи сайта интеграции, что приводит к производству EGFP в АВствие Gal4-VP16 производства. По нашим оценкам, 30-50% событий экспрессии EGFP обусловлены усиливающего ловушку и 50-70% обусловлены геном ловушку 23 (Balciuniene соавт. В стадии подготовки). Чтобы различать эти два класса событий, мы сделали 14xUAS: MRFP трансгенной линии (рис. 1В), для удобства отмечены объектива конкретных γCry: (. Balciuniene др. в стадии подготовки) GFP. Генной ловушки события проверяется коэкспрессией GFP и RFP (ср. С и D на рисунке 2).
В нашем пилотном экран, мы восстановлены более 40 генов ловушки события после проверки 270 F0 рыбу вводят смесью транспозонов ДНК и транспозазы мРНК. Двое из наших генов ловушки интеграции произошли в гены с ранее опубликованными химически индуцированных мутантов: NSF и FLr. Фенотипы нашей инсерционные мутантов NSF tpl6 и FLr tpl24 внешне неотличимы от фенотипас соответствующих химически индуцированных мутантов. Мы также отметили, что ген ловушки события появляются нужной интронов вблизи 5 'конца генов, тем самым увеличивая вероятность нулевых аллелей. Мы делаем наблюдать некоторую степень UAS глушителей (пестрота) во всех наших ген ловушки линий, и некоторые локусы явно более восприимчивы к пестроте, чем другие. Мы не верим, что БАС молчание является серьезной проблемой для распространения гена ловушки линий, как мы были в состоянии легко распространяются все наши ген ловушки линий по крайней мере пяти поколений, выбрав для выражения GFP в одиночку.
В генной ловушки векторы и методология, описанные здесь, уже используются в нескольких независимых лабораториях. По нашему опыту, есть два важных шагов в этом процессе. Первый важный шаг состоит в достижении высоких темпов интеграции ген ловушки в введенных эмбрионов F0. Невыполнение на этом этапе часто можно отнести к РНКазы загрязнения впрыска реагентов, особенно ДНК минипрепаративную. Кроме того, очень важно, чтобы придать эмбрионов на стадии 1 клеток для генной ловушки экспериментов. По нашему опыту, Tol2-опосредованной трансгенез очень эффективно, что делает возможным получение трансгенных линий даже при введении позднее стадии 1 клеток или с более низким качеством ДНК. Нестандартные инъекции намного более проблематичным при проведении генной ловушки мутагенеза, так как только небольшая часть векторных интеграции привести к эффективной событий генной ловушки. Второй критический этап заключается в выяснении генной ловушки событий путем скрещивания в наш БАС: MRFP линии. Отсутствие выражения MRFP являетсяпочти всегда свидетельствует о событии усилитель ловушки. Однако, иногда отсутствие экспрессии MRFP может указывать молчание на 14x БАС. Поэтому важно поддерживать UAS: MRFP линии в не замолчать государства путем распространения нового поколения с использованием лиц с выражением высокого RFP, когда подошел к NSF tpl6.
Мы можем предвидеть делая несколько улучшений для наших генов ловушки векторов и протокол. Первый состоит в использовании менее повторяющиеся UAS в генной ловушки конструкции. Было показано, что 5x UAS является достаточным для достижения полной активации в экспериментах культуре клеток, и что менее повторяющиеся последовательности UAS менее восприимчивы к метилирования и глушителей 6,25. Он также может быть возможно конструировать векторы генной ловушки для полностью условного мутагенеза, по аналогии с векторами, используемых в международной мыши ген ловушки консорциума и недавно приспособленных для данио 2,26,27. Еще одним усовершенствованием будет использовать другую тransposon система, например Спящая красавица 28, для создания UAS: MRFP репортер линии. Это позволило бы инъекцию генов ловушек Tol2 основе непосредственно в репортера линии и скрининга F0s по incrossing. Кроме того, это было бы отказаться от использования двух различных генетических предпосылок, что делает толкование потери функциональных фенотипов более простым. Даже с этими улучшения, общая Gal4 ген ловушка Протокол, представленные здесь все равно будет в полной мере применимы.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим доктора Дженнифер Emtage за критическое прочтение рукописи, Райан Гилл для оказания технической помощи и помочь с данио помощи и д-р Стивен С. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Миннесота) для реагентов. Наша работа была поддержана Храмовой Университетского колледжа науки и техники и Национального института здоровья (R01-HD061749).
Name of the Reagent/Material | Company | Catalog # | コメント |
Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. |