Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em> Drosophila</em> Los ovocitos

1. Preparación de moscas para la disección Anestesiar moscas sanas del genotipo deseado (por ejemplo, expresión de una proteína GFP-etiquetados) que están a menos de una semana de edad. Seleccione 10-15 hembras de gran tamaño con redondeados de color crema abdomen. Transfiera las moscas seleccionados y unos pocos machos (3-5) a un vial que contiene alimento nuevo a la ligera yeasted y permitir que las moscas para engordar durante dos días a 25 ° C. Consulte Weil et al. 6 para los detalles de la preparación de Drosophila. Engorde de las moscas se asegura de que una variedad de etapas, especialmente etapas 8-12, estará disponible para la formación de imágenes. Mal cebados o unfattened vuela por lo general contienen sólo etapas muy tempranas (1-6) y maduros ovocitos (fase 14). 2. Preparación de Ovocitos de Imagen Usando un microscopio compuesto Upright Preparar un portaobjetos de vidrio estándar mediante la colocación de dos cubreobjetos al portaobjetos, aproximadamente 1 cm de separación, utilizando de engrase de siliconae. Utilice sólo grasa suficiente para asegurar un buen sellado entre el cubreobjetos y portaobjetos. Presionando firmemente sobre cada cubreobjetos se extienda la grasa de la capa fina y uniforme. Añadir un poco de aceite de halocarbono 27 (Sigma) para la unión entre los cubreobjetos y se deslizan. Servirán como espaciadores para evitar herir a los ovocitos aislados en los pasos siguientes. No. de 1,5 cubreobjetos trabajar bien, con un espesor medio (0,16 a 0,18 mm) que coincide con la de ovocitos en fase tardía. Colocar 2-3 gotas de aceite de halocarbono 27 sobre la superficie de un cubreobjetos de 22 mm 2. Para obtener los ovocitos sanos posibles, una hembra se retira del vial alimentos utilizando pipeteo con la boca y suavemente depositado en el aceite de halocarbono sin anestesiar primero. Con fuertes pinzas de disección (como Dumont # 5), echar la mosca contra el cubreobjetos y salga de la punta del abdomen. Eliminar los ovarios arrastrándolos a lo largo de la superficie del cubreobjetos, bajo el aceite. Esto promoverá la adhesion de los oocitos para el cubreobjetos. Con cuidado separar los ovarios, en busca de ovocitos que son al menos 10B etapa de la ovogénesis. Los ovocitos en esta etapa pueden ser identificados mediante la búsqueda de cámaras de huevo en el que el ovocito ocupa al menos el 50-60% del volumen total de la cámara de huevos. En este punto de la ovogénesis, las células del folículo que recubren el ovocito se han convertido en columnar, y rodean el ovocito en todos los lados excepto por una pequeña región donde las conexiones con las células nodrizas permanecer. Usa los fórceps para extraer ovocitos individuales de la vaina ovariole. Proceder, usando a las mujeres 1-3, 5-8 oocitos intactos hasta que se han aislado en el cubreobjetos. Retire cualquier tejido inutilizable. Invierta cuidadosamente los cubreobjetos que contiene los ovocitos en el portaobjetos pre-preparado para que los oocitos se coloca entre los dos espaciadores. No ejerza presión sobre el cubreobjetos invertido como que dañará los ovocitos. Si es necesario, agregue una pequeña cantidad de aceite de hidrocarburo halogenado para tél bordes del "sandwich" para asegurar el espacio está lleno. (Opcional:. Dejar reposar diapositiva durante varios minutos para permitir la sedimentación de cubreobjetos) El portaobjetos ahora está listo para formación de imágenes. 3. Preparación de Ovocitos de Imagen Usando un microscopio compuesto invertido Los ovocitos se disecan esencialmente como se describe en la sección 2, excepto que las pequeñas cajas de Petri con una pieza de fondo de cristal (MatTek, 35 mm) se utilizan en lugar de cubreobjetos. No es necesario para cubrir la muestra, y después de la disección, el tejido puede ser captado directamente en los platos, pero se debe tener cuidado para asegurar que los oocitos permanecen cubiertos con aceite y no se permite que se seque. 4. Imágenes en directo Trae un ovocito en el foco o utilizando DIC óptica de contraste de fases y examinar el ovocito para detectar cualquier signo de daño, tales como fugas de citoplasma, o abombamiento de las células del folículo. Sólo imagen ovocitos que parecen sanos y en buen estado. Streaming se puede controlar directamente, sin la necesidad de etiquetado GFP, desde vesículas de yema en el citoplasma son autofluorescentes 7. Esta señal puede ser considerado en el rango FITC del alcance pero es probable que requiera más altos valores de ganancia que los utilizados para las proteínas GFP-etiquetados. Las mejores imágenes de transmisión se obtienen a partir de secciones ópticas que están justo debajo de la superficie del ovocito que descansa sobre el cubreobjetos de vidrio / Petri de vidrio. Aquí, el ovocito es ligeramente aplanada, para hacer un mejor plano de foco. Las imágenes pueden capturarse a 200X – 1.000 X. Usando la disposición descrita aquí, los objetivos de aire se debe utilizar, ya que el cubreobjetos forma una barrera entre el ovocito y objetivo. Esto es óptimo debido a que minimiza en gran medida la deriva y el movimiento de la muestra. Una vez que una región de interés está en el foco, desconecte la óptica brighfield y cambiar a imagen confocal. Con el rápido escaneo / función de vista previa del software, ajustar el enfoque y ganarsegún sea necesario. Configuración para la captura variará de microscopio para microscopio, pero los parámetros generales son las siguientes: Utilice una longitud de onda de excitación de ~ 488 nm y una longitud de onda de emisión de ~ 515 nm. Configurar eje Z de la captura de manera que el eje Z permanece constante, con un retraso de 10 segundos entre los marcos. Capturar una secuencia de ensayo de tramas 5-10 para asegurar el ovocito es estacionario y el plano de enfoque es apropiado. Una secuencia de lapso de tiempo típico capturar entre 20 a 50 marcos, y puede ser crítica inmediatamente después de la finalización para evaluar la calidad de vídeo. El proceso se puede repetir para otras células en el portaobjetos, o hembras adicionales puede ser diseccionado, según sea necesario. 5. Solución de problemas y común Drift – Cuando se utiliza un microscopio vertical, las células pueden desplazarse a veces debido a la propagación del petróleo. Esto puede minimizarse mediante el uso de sólo aceite suficiente para cubrir el área bajo el cubreobjetos. Si los problemas persisten, use menos g de siliconaREase para separadores colocará en la diapositiva. Nota: Algunos paquetes de software confocal permite el seguimiento de células, pero en general es mejor abandonar formación de imágenes de los ovocitos de la deriva, y utilizar en su lugar otro espécimen. No hay señales de transmisión streaming – Si no es evidente, es probable que se deba a una de dos causas: o bien el plano focal para la captura de la imagen no es correcto (por lo general demasiado profundamente en el interior del ovocito) o el ovocito está dañado. El tiempo y la práctica puede minimizar tanto los errores.