でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em>ショウジョウバエ</em>卵母細胞

1。解離のハエの準備古い1週間未満アール所望の遺伝子（例えば、GFP標識タンパク質を発現する）の健康なハエを麻酔。丸みを帯びたクリーム色の腹部に10月15日大きなメスを選択します。 新しい軽くyeasted食品を含むバイアルに選択されたハエや少数（3-5）男性を転送し、ハエは25℃で2日間太らせることができショウジョウバエの準備の詳細については、ワイルら 6を参照してください。肥育ハエは、ステージの様々な、特にステージ8月12日は、イメージングに利用できることが保証されます。不十分肥育またはunfattenedすると、通常はごく初期段階（1-6）と成熟（ステージ14）卵母細胞が含まれて飛ぶ。 2。直立複式顕微鏡を用いたイメージングのための卵母細胞の調製シリコーンgreasを使用して、約1cm離れて、スライドにカバーガラス2を貼付することによって、標準ガラススライドを準備電子。唯一のカバーガラスとスライドとの間の良好なシール性を確保するのに十分なグリスを使用しています。各カバースリップをしっかりと押すと、薄く均一にグリスを広めるでしょう。カバーガラスとスライド間の接合部にいくつかのハロカーボン油27（シグマ）を追加します。彼らは、以降の手順で隔離された卵母細胞を傷つけることを防ぐためにスペーサーとして機能します。第1.5カバーガラスは、後期の卵母細胞のものと一致する平均厚さ（0.16〜0.18ミリメートル）で、うまく機能します。 場所2-3は、22ミリメートル2カバーガラスの表面にハロカーボン油27滴。できるだけ健康な卵母細胞を得るためには、個々の女性は、口ピペッティングを用いた食品のバイアルから削除され、静かに第一麻酔なしでハロカーボン油に堆積される。 鋭い解剖鉗子（例えばデュモン＃5など）を使用し、カバースリップに対するハエを固定し、腹部の先端をやってのける。油の下、カバースリップの表面に沿ってドラッグすることにより、卵巣を取り外します。これは、索状帯を推進していきますカバースリップに卵母細胞のn。 そっと卵形成の少なくともステージ10Bアール卵母細胞を探し、卵巣を離れていじめる。この段階での卵母細胞は、卵母細胞、卵室の総容積の少なくとも50から60パーセントを占めている卵室を検索することで識別することができます。卵形成のこの時点では、卵母細胞を覆う包細胞は円柱状となっており、ナース細胞への接続が残っている小さな領域を除いて、すべての側面に卵母細胞を囲む。卵巣管シースから個々の卵母細胞を除去するためにピンセットを使用しています。 5月8日無傷の卵母細胞をカバーガラスで隔離されるまで、1〜3人の女性を使用して、進みます。任意の利用不能組織を除去する。 慎重に卵母細胞が2つのスペーサーとの間に配置されるように、あらかじめ用意したスライド上に卵母細胞を含むカバースリップを反転させる。それは卵母細胞を傷めますので、反転カバースリップを押し下げないでください。必要であれば、tにハロカーボンオイルを少量加える"サンドイッチ"の彼は縁のスペースを確保するためには満たされている。 （オプション：カバースリップの沈降を可能にするために数分間スライド休息しましょう​​）のスライドは今イメージングのための準備ができています。 3。倒立複合顕微鏡を用いたイメージングのための卵母細胞の調製セクション2で説明したようにガラス底のインサート（マテック、35ミリメートル）でその小さなペトリ皿をカバーガラスの代わりに使用された卵母細胞を除いては、基本的に解剖されています。これは、検体をカバーする必要がなく、解剖後、組織を皿で直接画像化することができますが、注意が卵母細胞は油で覆われており、完全に乾くことは許されません残っているように注意する必要があります。 4。ライブイメージング DICや位相コントラスト光学系を用いた焦点に卵を持参し、そのような細胞質の漏出、または包細胞の膨らみなどの損傷の形跡がないかを卵母細胞を調べます。健康で損傷していない画像のみが表示された卵母細胞。 Strea細胞質内に卵黄胞が7自家あるので銘は、GFP標識を必要とせずに、直接監視することができます。この信号は、オシロスコープのFITCの範囲に取り込むことができますが、可能性が高いGFP標識タンパク質で使用されているものよりも高いゲイン設定が必要になります。 ストリーミングの最高のイメージがちょうどガラスカバースリップ/ペトリガラスに載っている卵母細胞の表面の下にある光のセクションから取得されます。ここでは卵母細胞は、わずかにピントの良い面のために作り、平坦化される。画像は200Xで捕捉することができます – 千X.カバースリップが卵母細胞と客観の間に障壁を形成するので、ここで説明した構成を使用して、空気の目的は、使用されるべきである。それが大幅にサンプルのドリフトや動きを最小限に抑えられるため、これが最適です。 関心領域が合うと、brighfield光学系をオフにして、共焦点イメージングに切り替えます。ソフトウェアの高速スキャン/プレビュー機能を使用して、フォーカス調整とゲイン必要に応じて。 キャプチャの設定は顕微鏡から顕微鏡に異なりますが、一般的なパラメータは次のとおりです。〜488nmの励起波長および〜515nmの発光波長を使用します。 Z軸はZ軸がフレームの間に10秒の遅れで、一定になるようにキャプチャを設定します。卵母細胞は静止しており、焦点面が適切であることを確認するために5から10フレームのテストシーケンスをキャプチャします。 典型的な時間経過のシーケンスは、20の間にキャプチャされます – 50フレーム、ビデオ品質を評価するために、完成した直後に確認することができます。プロセスは、スライド内の他のセルに対して繰り返すことができる、または、必要に応じて追加の女性を解剖することができます。 5。トラブルシューティングとよくある問題ドリフトは – 正立顕微鏡を使用する場合、細胞は時々油の拡散のためにドリフトすることができます。これは、カバーガラスの下の面積をカバーするために必要なだけのオイルを使用することによって最小限に抑えることができます。問題が解決しない場合は、少ないシリコーンgを使用するスライドに接辞スペーサーにrease。 注：一部の共焦点ソフトウェアパッケージは細胞追跡を可能にするが、一般的にそれが漂って卵母細胞のイメージングを断念し、代わりに別の試験片を使用することをお勧めします。 ストリーミングの兆候は – ストリーミングが明らかでない場合、それはおそらく2つの原因のいずれかが原因ではない、どちらかの画像キャプチャのためのフォーカルプレーンが正しくありません（卵母細胞の内部に通常は深すぎる）または卵母細胞が損傷しています。時間と練習が両方のエラーを最小限に抑えることができます。