חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em> דרוזופילה</em> ביציות

1. הכנת זבובים לנתיחה הרדם זבובים בריאים של גנוטיפ הרצוי (לדוגמה, מבטא חלבון ה-GFP שכותרת-) שהם פחות משבוע ישן. בחר 10-15 נקבות גדולות עם בטן בצבע שמנת מעוגלת. להעביר את הזבובים הנבחרים וכמה (3-5) זכרים לבקבוקון המכיל מזון קל yeasted חדש ולאפשר את הזבובים להשמין במשך ימים ב 25 ° C. עיין וייל ואח'. 6 לפרטים של הכנת דרוזופילה. פיטום הזבובים מבטיחים כי מגוון שלבים, במיוחד שלבים 8-12, יהיה זמין להדמיה. פטם גרוע או unfattened טס בדרך כלל מכיל רק שלבים מוקדמים מאוד (1-6) ו( שלב 14) ביציות בשלות. 2. הכנה של ביציות לדימות באמצעות מיקרוסקופ מתחם זקוף הכן שקופית זכוכית רגילה ידי הדבקת 2 coverslips לשקופית, מלבד כ 1 סנטימטר, באמצעות greas סיליקוןדואר. השתמש רק בגריז מספיק כדי להבטיח איטום טוב בין coverslip והשקופיות. לחיצה כלפי מטה בחוזקה בכל coverslip תתפשט הגריז דק ואחיד. הוסף מעט שמן halocarbon 27 (Sigma) לצומת בין coverslips והשקופיות. הם ישמשו כמפרידים כדי למנוע פציעת ביציות מבודדות בשלבים הבאים. המספר 1.5 coverslips עובד היטב, עם עובי ממוצע (0.16-0.18 מ"מ) שתואם לזה של ביציות בשלב מאוחרת. מקום 2-3 טיפין של שמן halocarbon 27 על פני השטח של 2 מ"מ coverslip 22. כדי לקבל את הביציות הבריאות ביותר האפשריות, נשי פרטית יוסר מבקבוקון המזון באמצעות pipetting פה והונח בעדינות לתוך שמן halocarbon בלי ההרדמה ראשונה. שימוש במלקחי מנתחים חדים (כגון דומון # 5), להצמיד את הזבוב נגד coverslip ולמשוך את קצה הבטן. הסר את השחלות על ידי גרירתם על פני השטח של coverslip, תחת השמן. זו תקדם adhesion של הביציות לcoverslip. בעדינות להקניט מלבד שחלות, מחפש ביציות כי הם לפחות 10B השלב oogenesis. ביציות בשלב זה ניתן לזהות על ידי מחפש תאי ביצה שבביצית מעסיקה לפחות 50-60% מהנפח הכולל של תא הביצה. בנקודה זו בoogenesis, את תאי הזקיק המונחים על הביצית הפכו עמודים, ומקיפים את הביצית מכל צדדיו, פרט לאזור קטן שבו חיבורים לתאי האחות יישארו. השתמש במלקחיים כדי להסיר ביציות בודדות מנדן ovariole. להמשיך, באמצעות 1-3 נקבות, עד 5-8 ביציות שלא נפגעו היו מבודדות על coverslip. הסר את כל רקמת unuseable. זהירות להפוך coverslip המכיל את הביציות לשקופית המוכנה מראש כדי שהביציות מוצבות בין שני מפרידים. אל תלחץ על coverslip ההפוך כמו שיפגע בביציות. במידת צורך, להוסיף כמות קטנה של שמן לhalocarbon tהוא הקצוות של "הכריך" כדי להבטיח את המקום מלאים. (אופציונלי:. בוא שקופית מנוחה לכמה דקות כדי לאפשר ליישוב של coverslip) השקופיות מוכנות כעת להדמיה. 3. הכנה של ביציות לדימות באמצעות מיקרוסקופ מתחם הפוך ביציות הם נתחו למעשה כאמורים בסעיף 2, פרט לכך שצלחות פטרי הקטנות עם הוספת תחתית זכוכית (מאטק, 35 מ"מ) משמשות במקום coverslips. מיותר כדי לכסות את הדגימה, ולאחר נתיחה, רקמה יכולה להיות צלמה ישירות בכלים, אבל יש להקפיד על מנת להבטיח את הביציות תישארנה מכוסית בשמן ואסור להתייבש. 4. חי הדמיה הבא את הביצית אל מוקד באמצעות דסק"ש או אופטיקה לעומת שלב ולבחון את הביצית לכל סימן של ניזק, כגון דליפה בציטופלסמה, או בולט של תאי זקיק. ביציות רק תמונה שמוצגות בריאים ולא ניזוקו. Streaמינג ניתן לפקח באופן ישיר, ללא צורך בתיוג GFP, מאז שלפוחית ​​חלמון בציטופלסמה היא autofluorescent 7. אות זה יכול להיות שנתפסה בטווח של FITC ההיקף אך סביר להניח כי צורך בהגדרות רווח גבוהות יותר מאלה המשמשים לחלבוני ה-GFP שכותרת-. את התמונות הטובות ביותר של הזרמה מתקבלות מחלקים אופטיים שמתחת לפני השטח של הביצית שמונחת על זכוכית זכוכית coverslip / פטרי. הנה הביצית היא שטוחה מעט, מה שהופך למטוס טוב יותר מפוקוס. תמונות יכולות להיות שנתפסו ב200X – 1000 X. באמצעות ההסדר שתואר כאן, מטרות אוויריות צריכות לשמש, מאחר coverslip יוצר מחסום בין הביצית והאובייקטיבית. זה אופטימלי כי זה מאוד מצמצם סחף ותנועה של המדגם. ברגע שאזור של עניין הוא בפוקוס, כבה את אופטיקה brighfield ולעבור להדמית confocal. השימוש בפונקציית הסריקה / תצוגה מקדימה המהירה של התוכנה, להתאים להתמקד ולהשיגבמידת צורך. הגדרות עבור לכידה תשתנינה ממיקרוסקופ למיקרוסקופ, אבל פרמטרים כלליים הם כדלקמן: השתמשו באורך גל עירור של 488 ננומטר ~ וגל פליטה של ​​~ 515 ננומטר. הגדר את ציר Z-לכידה כך שציר Z-נשאר קבוע, בפיגור של 10 שניות בין מסגרות. לכידת רצף מבחן המסגרות 5-10 כדי להבטיח הביצית היא נייחת והמטוס של מוקד הוא מתאים. רצף זמן פקיעה טיפוסי יהיה ללכוד בין 20-50 מסגרות, וניתן לסקור באופן מיידי לאחר השלים להעריך את איכות וידאו. התהליך ניתן לחזור לתאים אחרים בשקופית, או נקבות נוספות ניתן גזור לפי צורך. 5. פתרון בעיות ומשותפות להיסחף – בעת שימוש במיקרוסקופ זקוף, תאים יכולים לעתים להיסחף בשל התפשטות של נפט. זו ניתן למזער באמצעות מספיק שמן רק כדי לכסות את השטח שמתחת לcoverslip. אם בעיות נמשכות, השתמש גרם סיליקון פחותrease למפרידים מדביקים על השקופית. הערה: חלק מחבילות תוכנת confocal לאפשר מעקב תא, אך באופן כללי, עדיף לזנוח את ההדמיה של ביציות נסחפו ובמקום להשתמש בפריט נוסף. אין סימנים של זרימה – אם ההזרמה לא ברורה, סביר להניח בשל אחת משתי סיבות: או שמישור המיקוד ללכידת תמונה הם לא נכונים (בדרך כלל עמוק מדי לתוך הפנים של הביצית) או הביצית פגומה. זמן ותרגול יכולים למזער שתי טעויות.