يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em> ذبابة الفاكهة</em> البويضات
概要
بروتوكول للتصوير حي للبروتينات GFP الموسومة أو هياكل autofluorescent في الفردية<em> ذبابة الفاكهة</emيوصف> البويضات.
Abstract
تم تأسيس بويضة ذبابة الفاكهة كنظام تنوعا للتحقيق في أسئلة أساسية مثل وظيفة هيكل الخلية، وتنظيم الخلية، وبناء عضية وظيفة. توافر مختلف البروتينات GFP الموسومة يعني أنه يمكن رصد العديد من العمليات الخلوية في الخلايا الحية على مدى دقائق أو ساعات، وباستخدام هذه التقنية، وقد وصفت عمليات مثل نقل RNP، التشكل الظهارية، وإعادة عرض الأنسجة بقدر كبير من التفصيل في ذبابة الفاكهة 1،2 البويضات.
القدرة على أداء التصوير الفيديو جنبا إلى جنب مع ذخيرة غنية من المسوخ يسمح للفحص مجموعة متنوعة هائلة من الجينات والعمليات بالتفصيل لا يصدق. أحد الأمثلة على ذلك هو عملية تدفق ooplasmic، الذي يبدأ في منتصف oogenesis 3،4. هذه الحركة قوية من الحويصلات السيتوبلازمية هو أنيبيب و 5 كينيسين التي تعتمد على أنظمة ويوفر مفيدةتيم للتحقيق وظيفة الهيكل الخلوي في هذه المراحل.
هنا أقدم على بروتوكول للتصوير الفاصل الزمني من البويضات الحية باستخدام تقريبا أي الإعداد المجهري متحد البؤر.
Protocol
Representative Results
Discussion
ذبابة الفاكهة هي البويضات نظام نموذجي تنوعا لمعالجة مجموعة متنوعة من المسائل المتصلة الدالة وتنظيم الخلايا والمكونات التحت خلوية. A فهم كامل وظيفة البروتين يتطلب رصد كل الجوانب المكانية والزمانية للسلوك البروتين. التقدم في كل من نظم التصوير والأدوات الجينية المتاحة لDrosophilists تجعل من الممكن للمختبرات حتى الصغيرة لأداء عالية الجودة في التصوير التجارب البويضات المعيشة. هنا أتناول بروتوكول لتحليل سلوك البروتينات GFP الموسومة أو autofluorescent والهياكل خلال منتصف إلى أواخر oogenesis التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية للتحقيق وظيفة البروتين.
في هذا البروتوكول أصف العملية التي يتم إعداد البويضات للتصوير والإعدادات الأساسية التي ستمكن مبائر الحصول على الفيديو الفاصل الزمني من البروتينات الفلورية والهياكل. التفصيل إضافيةويرد وصف ليرة سورية على إعداد البويضة بواسطة ويل وآخرون. 6 A مجموعة واسعة من سلالات ذبابة معربا عن البروتينات التي تم وسمها التطور الطبيعي عبر محاصرة-اكسون تتوفر 8، ويمكن تصميم المتغيرات البروتين أكثر بلا حدود ويعيد إلى الذباب.
في العمل مع الأنسجة الحية، وصحة العينات له أهمية قصوى. يمكن البيض من غرف 10B مرحلة استكمال oogenesis بطريقة مستقلة أساسا 11، مما يجعلها مثالية للدراسات قصيرة الأجل التصوير. يجب توخي الحذر في الخطوات الرئيسية عدة للحصول على بيانات ذات جودة عالية. خلال تشريح أنه من المهم لمعالجة المبيضين البويضات وأقل قدر ممكن، والحد من مقدار الوقت بين تشريح والانتهاء من التصوير. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون موجودا محطة تشريح صغيرة في نفس الغرفة التي تضم نطاق مبائر، وينبغي تصوير فقط غرف البيض قليلة في كل مرة. عدد الموصى بها هنا (5-8) يضمن أن يتم تصغير الوقت تشريح مع تعظيم احتمال الحصول على صور ذات جودة جيدة. أوصي التقاط سلسلة من الصور قصيرة لتقييم جودة الصورة والتأكد من أن يتم تحسين إعدادات الالتقاط، قبل التقاط مرور وقت أطول تسلسل. معظم البرامج تسمح ليتم حفظها الإطارات الفردية، ويمكن بعد ذلك يتم تحليل هذه الصور في مجموعة متنوعة من الطرق باستخدام يماغيج 12 أو البرامج الأخرى.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل منحة من برنامج GM096076 AREA NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog number | コメント |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
参考文献
- Becalska, A. N., Gavis, E. R. Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis. Dev. 136, 2493-2503 (2009).
- He, L., Wang, X., Montell, D. J. Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development. Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).
- King, R. C. . Ovarian development Drosophila melanogaster. , (1970).
- Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).
- Serbus, L. R., Cha, B. -. J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes. Dev. 132, 3743-3752 (2005).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).
- Theurkauf, W. E. Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes. Science. 265, 2093-2096 (1998).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. PNAS. 98, 15050-15055 (2001).
- Röper, K. Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components. J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).
- Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations. Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).
- Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium. Wilhelm Roux’s Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).
