膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

1。準備する試薬必要になるまで無菌膣洗浄は、再蒸留水（蒸留H 2 O）をオートクレーブ滅菌し、室温で密閉容器に保管してください。 細胞学的評価のために、蒸留H 2 Oを100mlにクリスタルバイオレットの粉末0.1グラムを追加よく混ぜる。必要になるまで、クリスタルバイオレット染色液（0.1％）を室温で密閉容器に保存することができます。 2。収集膣細胞（膣胞洗浄） 無菌200μlの先端の先端にラテックス球を置き、滅菌蒸留H 2 Oは、ボリュームの指針となるべきものとして、先端にグラデーションを使用しての約100μlを描く。 彼女のケージのマウスを持ち上げて、あなたに向かって彼女の後肢/後端にケージホッパー（フタ）の上に彼女を置く。 しっかりと尻尾をつかんで後端を持ち上げる。マウスは今ホッパーを把握するだけで彼女の前足を持つことになります。この時点でマウスが排尿することがあります。もしそうなら、排尿が止まるまで待ちます。そこに膣の入り口に残った尿である必要があり、個別の先端（ すなわち 、あなたのサンプル採取チップ）を使用して過剰ddH 2 Oで口をすすぐことをお勧めします。 膣（および頸部）刺激がラットの1,2に偽妊娠を誘発することができるようにオリフィスを貫通しないように注意しながら膣の開口部ddH 2 Oを充填したチップの先端を置きます。最近の報告では、マウスは、この効果の影響を受けにくくなりますそれにもかかわらず、注意を繰り返し分析3の侵襲の程度を最小限に抑えるよう注意が必要を示唆している。 優しく膣管のオープニングで水の体積の半分（〜25から50μl）に四半期を排出するバルブを押し下げる。液体が自発的に先端挿入せずに管の中に吸引されます。ゆっくり電球に加わる圧力を解放します。流体は、先端に戻って撤退します。流体の吸引を防ぐために、早すぎる圧力の放出を避ける電球に。たばこのフィルターは、この目的のために有用であろう。 単一試料中に十分な細胞数を得るために、同じチップ、電球、および流体を使用して、前のステップ4から5回繰り返します。 スライドガラス上に液を入れ、汚れが完全に室温で乾燥することができます。一度乾燥した、これらの発情塗抹標本を直ちに染色または保存され、後日染色することができる。 3。クリスタルバイオレットを用いて細胞染色法* 4 クリスタルバイオレットが1分間染色含むコプリンジャー（または他の同等の染色槽）で乾式スライドを配置します。 蒸留H 2 Oを含有する第二のコプリンジャーに取り外し1分間ddH 2 Oでスライドを洗浄します。繰り返します。 染色塗抹との接触を避け、軽量組織ワイパー付きスライドの端から過剰蒸留H 2 Oを削除します。 スミアとカバーの上部にあるグリセロールのピペット約15μlのスリップ。あるいは、他の組織学的マウンティング試薬は、非拡散、より恒久的な染色を得るために利用することができます。 ここで説明する*染色法は、どの研究室で行うことができる最も簡単な手順です。他の方法としては、追加の詳細を提供することができます。たとえば、パパニコロウ染色を用いて、有核上皮細胞の成熟度は、染色されたターコイズと、より成熟した細胞は、ピンクやオレンジ色に染色された未成熟細胞と区別することができます。これらの違いは、早朝または深夜の発情前期を上演するために使用できます。4 4。膣細胞診現在のセルの種類を決定するために光学顕微鏡下で塗抹を調べます。顕微鏡検査は、封入のためにグリセロールを使用しているとき、クリスタルバイオレットは時間をかけて細胞から拡散するように染色した後、直ちに行われるべきである。顕微鏡写真では、細胞診を文書化するために、分析の際に取られるべきである。 entirを調べることから始め低倍率のe塗抹。代表的な地域を選択して、高倍率に移動します。あなたは、角化扁平上皮細胞、白血球、および/ ​​または有核上皮細胞（ 代表的な結果は、 図1A〜C）が表示されます。存在する細胞の割合は、サンプル採取（ 代表的な結果は、 図1D-G）と彼女の即時のホルモン状態の時間（ ディスカッション 、 図2）でマウスの発情期を決定することができます。 5。代表的な結果 細胞診：3つの主要な種類の細胞は膣塗抹標本で検出することができる：（1）有核上皮細胞（ 図1A）、（2）角化扁平上皮細胞（ 図1B）、（3）白血球（ 図1C）。有核上皮細胞が染色された細胞質軽く、暗いステンド形質膜、および楕円形の核を持っている（ <strオング>図1A）。角化扁平上皮細胞はそれらの有核上皮前任者よりも、より多角形状、均一に染色され、核（ 図1B）を欠いている。多形核白血球は、その不規則な形状、暗くステンドポリモーフィック型核、小サイズ（ 図1C、黒矢印）によって上皮細胞と区別することができる。尿汚染がスメア中に存在すべきである、尿酸の結晶が容易に予想される、任意の細胞型（ 図3）に似ていないその結晶構造によって検出されます。これが発生し、優勢な細胞型の曖昧な検出すべき、スミアは破棄され、目的のステージング用に使用すべきではない。 ステージング：塗抹標本で観察された細胞型の相対比は、サンプル採取の日（ 図1D-G）の上でマウスの発情周期のステージを識別するために使用することができます。発情前期の間に、細胞がほぼ独占的にアールラウンドのクラスタ、整形式有核上皮細胞（ 図1D、白い矢印で示さ代表セル）。発情期の間に、細胞が密集したクラスター内に存在し、主に角化扁平上皮細胞（ 図1E、矢印で示す代表的な細胞）である。発情後期中に、小さなステンド暗く白血球（ 図1F、黒い矢印で示された代表的な細胞）が優勢。角化扁平上皮細胞は、しばしば断片（ 図1F、黒矢印で示す代表的なセル）で、観察することができる。発情間期の間に、珍しい角化扁平上皮細胞はまだ（ 図1G、黒矢印で示す代表的な細胞）が存在しているかもしれませんが、白血球はまだ（ 図1G、黒い矢印で示された代表的な細胞）が優勢。発情後期は発情間期中の有核上皮細胞の出現によって発情間期と区別することができる（ <stronグラム>図1G、白い矢印で示さ代表セル）。 図1。 （A）は、有核上皮細胞、（B）は角化扁平上皮細胞、および（C）白血球：膣スメアの細胞学的評価は、主に次の3つの種類の細胞が膣塗抹標本で検出された発情段階を識別するために使用することができます 。塗抹標本内に存在これらの細胞型の比率は代表的な結果で説明したように（D）発情前期は、（E）は発情期が、（F）は発情後期、または（G）は発情間期のマウスを識別するために使用することができます。代表的な角化扁平上皮細胞へのE、FおよびGポイントの黒矢印。代表leykocytesにC、F、Gの点の黒矢印。 DおよびGハイライト代表の白い矢印は上皮細胞核。 jpgのは "alt ="図2 "/> 図2。膣スメア細胞診は、基礎となる内分泌事象を反映しています詳細はまたディスカッションで提供されています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図3。尿酸の結晶が尿に汚染されたサンプルの現在の次のクリスタルバイオレット染色可能性があります （A）の結晶は透明であり、様々なサイズ（矢印と（B）に拡大された箱入りの領域）にすることができます。無細胞はこの分野に存在していない。細胞学的染色のために使用されるフ​​ィールド内で尿酸結晶の汚染が存在する必要があります、それは正確に存在し、塗抹標本を廃棄すべきセルの種類を識別することは困難かもしれません。スケールバー=50μmである。