Placa de Ensayo para Norovirus murino

El método de ensayo de placa para MNV-1 se presenta aquí es una forma de cuantificar partículas infecciosas de MNV. Siguiendo los pasos del ensayo se ilustra en la Figura 3, se puede obtener reproducibles títulos virales. El límite de detección del ensayo depende de la dilución de partida utilizado. Cuando comenzando con una dilución 1:10 de la muestra como se describe anteriormente, el límite de detección del ensayo de placa es de 10 ufp (es decir, 1 placa visible en la dilución 10 ^-1). Dado que cada placa representa un solo virus, el ensayo en placa también se puede utilizar para purificar poblaciones clonales de MNV recogiendo placas aisladas y propagar ellos como se ha descrito anteriormente ^1. Además, purificaciones en placa también se puede utilizar para separar una población de virus individuales de poblaciones de virus mezclados. Una limitación del uso de un ensayo de placa para la detección de infección MNV es que no todas las cepas MNV formar placas ^4. Sin embargo, puede ser posible superar la inability de algunas cepas MNV, aisladas de animales, para formar placas por pases en serie estos virus en cultivo de tejido ^7. Una alternativa a la placa de ensayo es medir partículas infecciosas a través de la técnica de TCID ₅₀ ^{3, 4.} Este ensayo cuantifica la cantidad de virus necesaria para producir CPE en 50% de las células de cultivo de tejidos inoculados tras diluciones de punto final y toma 1 semana para completar para MNV ^4. Además de ser más lento que un ensayo en placa, el ₅₀ TCID ensayo es también no es tan sensible (límite de detección = 200 TCID ₅₀ / ml), debido a la toxicidad de las muestras de tejido para células RAW 264,7 ^4.

A pesar de los pasos críticos dentro del protocolo se han descrito en todo el protocolo, la siguiente sección se ofrece un resumen para facilitar la resolución de problemas. El paso más crítico en el protocolo es asegurar que RAW 264,7 células permanecen viables durante todo el ensayo para apoyar la replicación del virus. Esto puedeun control en cada etapa del ensayo a través de microscopía de luz. La viabilidad celular se garantiza de dos maneras. En primer lugar, se debe tener cuidado de no permitir que las células se secan durante la manipulación de placas. Por lo tanto, las placas se inoculan uno a la vez, sacudió durante el período de infección, y debe permanecer cerrado cuando no están siendo manejados. En segundo lugar, las soluciones de añadirse a las células deben equilibrarse a ~ 37 ° C. Además, es vital para la salud general de las células RAW 264,7 para su mantenimiento en medios que contienen suero de endotoxina bajo (<10 EU / ml), lo que limita la activación de las células. Además, hemos observado una mayor tasa de fracaso de la placa de ensayo utilizando las células de pasaje 30 o superior. Aunque esto probablemente variará de un laboratorio a otro, es importante incluir un control positivo (por ejemplo, una muestra con un título viral conocida) para asegurar títulos reproducibles, especialmente cuando se utilizan mayores pasaje células RAW 264,7. Para limitar el uso de células de paso superior, es aconsejable para congelar viales de principios passage células a la recepción de RAW 264,7 células y comenzar una nueva cultura de los viales congelados con frecuencia. Empezar de nuevo con bajas culturas pasaje celular también será útil cuando las células presentan características alteradas, tales como la falta de adhesión, los cambios en la morfología celular (por ejemplo, de redonda a larguirucha y hacia fuera), o cuando la contaminación por micoplasmas se ha detectado. Otro punto importante prestar atención a es asegurar que las puntas de pipeta se cambian entre las muestras y durante las diluciones. Esto asegurará precisos diluciones en serie y evitar la contaminación cruzada entre las muestras. El primer paso en el protocolo donde se encuentra la punta de la pipeta mismo es utilizado de nuevo cuando diluciones en serie de la misma muestra se añaden a los pocillos. En ese caso, hay que comenzar desde el inóculo más diluido a lo menos, y vigorosamente pipetear hacia arriba y abajo en la elaboración de una nueva dilución.

El protocolo de ensayo de placa es enmendable de varias modificaciones. Una modificación que puede hacerse cuando taquí no son suficientes células para la inoculación de los pocillos por duplicado es inocular sólo un único pocillo de cada dilución. Sin embargo, puesto que el volumen del inóculo es 0,5 ml, el número de placas luego tiene que ser multiplicado por un factor de 2 para normalizar a pfu / ml. El ensayo en placa también se puede adaptar para su uso con cualquier otra línea celular adherente que es capaz de soportar la replicación de MNV, y esto se ha descrito para la línea de murino microglial BV-2 de células ^8. Otras modificaciones que se pueden aplicar son adaptaciones que se han descrito para los protocolos de la placa de ensayo desarrollados para otros virus. En caso de MNV, las siguientes modificaciones ya se han aplicado con éxito, el uso de celulosa de metilo en lugar de agarosa Sea Plaque ^9, y la tinción de las células con cristal violeta o azul de metileno en lugar de rojo neutro ^{10, 11.}

En general, este protocolo se puede adaptar fácilmente según sea necesario para cuantificar otras formadoras de placas o virus utilizado para OTHer los virus que causan las infecciones líticas en RAW 264,7 células, lo que hace que sea una herramienta útil para cuantificar partículas virales infecciosas en general.