Saggio di placca per Norovirus Murine

Il metodo di analisi per la targa MNV-1 qui presentato è un modo di quantificare particelle infettive MNV. Seguendo la procedura del saggio illustrato in figura 3, si possono ottenere i titoli virali riproducibili. Il limite di rilevazione del test dipende dalla diluizione di partenza utilizzato. Quando si inizia con una diluizione 1:10 del campione come descritto sopra, il limite di rilevazione del saggio di placca è 10 pfu (cioè, 1 placca visibile a ^-1 10 diluizione). Poiché ogni placca rappresenta un singolo virus, il saggio di placca può anche essere usato per purificare popolazioni clonali di MNV sollevando placche isolate e moltiplicazione come descritto in precedenza ^1. Inoltre, purificazioni placca può anche essere utilizzato per separare una singola popolazione virus da popolazioni miste virus. Una limitazione di utilizzo di un saggio di placca per la rivelazione di infezione MNV è che non tutti i ceppi MNV formare placche ^4. Tuttavia, può essere possibile superare la inabilità di alcuni ceppi MNV, isolati da animali, per formare placche in modo seriale passaging questi virus in coltura ^7. In alternativa al saggio di placca è misurare particelle infettive tramite TCID ₅₀ tecnica ^{3, 4.} Questo test quantifica la quantità di virus necessaria per produrre CPE nel 50% delle cellule del tessuto inoculate colture seguenti diluizioni endpoint e prende 1 settimana a completare per MNV ^4. Oltre ad essere più lenta di un saggio di placca, la TCID ₅₀ saggio è così sensibile (limite di rilevazione = 200 TCID ₅₀ / ml) a causa della tossicità dei campioni di tessuto di cellule RAW 264,7 ^4.

Anche se i passaggi critici nell'ambito del protocollo sono stati descritti in tutto il protocollo, la sezione seguente fornisce una sintesi per facilitare la risoluzione dei problemi. La fase più critica del protocollo è quello di garantire che RAW 264,7 cellule rimangono vitali durante tutta la seduta di sostenere la replicazione del virus. Questo puòessere monitorato in ogni fase del test tramite microscopia ottica. La vitalità cellulare è assicurata in due modi. In primo luogo, si deve prestare attenzione a non far asciugare le cellule durante la manipolazione di lamiere. Così, le piastre vengono inoculati uno alla volta, scosso durante il periodo di infezione, e deve rimanere chiuso quando non sono stati trattati. In secondo luogo, le soluzioni aggiunto su cellule devono essere equilibrati a ~ 37 ° C. Inoltre, è essenziale per la salute generale delle cellule RAW 264,7 mantenerle in terreni contenenti siero partire endotossina (<10 EU / ml), che limita l'attivazione delle cellule. Inoltre, abbiamo osservato un tasso di fallimento superiore del saggio di placca usando cellule dal passaggio 30 o superiore. Anche se questo probabilmente variano da laboratorio a laboratorio, è importante includere un controllo positivo (ad esempio, un campione con un titolo virale noto) per garantire titoli riproducibili, soprattutto quando si utilizzano più elevati passaggio RAW 264,7 cellule. Per limitare l'uso di cellule di passaggio più elevati, si consiglia di congelare fiale del primo Passacellule ge dopo il ricevimento del RAW 264,7 cellule e iniziare una nuova cultura dai flaconi congelati frequentemente. Si riparte con colture cellulari a basso passaggio sarà anche utile quando le cellule presentano caratteristiche alterate, come ad esempio il mancato rispetto, i cambiamenti della morfologia cellulare (ad esempio, da rotondo a esile ed estesa), o quando la contaminazione da micoplasma è stato rilevato. Un altro punto importante da prestare attenzione è di garantire che i puntali delle pipette sono cambiati tra i campioni e durante le diluizioni. In questo modo garantire l'accuratezza dei diluizioni seriali e prevenire la contaminazione incrociata tra i campioni. Di un passo nel protocollo in cui il puntale stesso può essere utilizzato nuovamente quando diluizioni seriali dello stesso campione vengono aggiunti ai pozzetti. In tal caso, si deve partire da l'inoculo più diluito al minimo, e vigorosamente pipettare su e giù al momento di elaborare una nuova diluizione.

Il protocollo del saggio placca è modificabile di numerose modifiche. Una modifica che possono essere effettuate quando tqui non sono cellule sufficienti per vaccinare i pozzi in duplice copia è di inoculare solo un singolo pozzo per ogni diluizione. Tuttavia, poiché il volume dell'inoculo è 0,5 ml, il numero di placche deve poi essere moltiplicato per un fattore di 2 per normalizzare a pfu / ml. Il saggio di placca può anche essere adattato per l'uso con qualsiasi altra linea cellulare aderente che è in grado di supportare la replica di MNV, e questo è stato descritto per la linea murina microglia BV-2 cella ^8. Altre modifiche che possono essere attuate sono adattamenti che sono stati descritti per i protocolli di test placca sviluppati per altri virus. In caso di MNV, le seguenti modifiche sono già state realizzate con successo, l'uso di metil cellulosa invece di placca Mare agarosio ^9, e la colorazione delle cellule con violetto cristallo o blu di metilene al posto del rosso neutro ^{10, 11.}

Nel complesso, questo protocollo può essere facilmente adattato per quantificare altri formanti placca virus o utilizzati per OTHer virus che causano infezioni litiche in RAW 264,7 cellule, che lo rende uno strumento utile per quantificare particelle virali infettive in generale.