Plaque-Assay für Murine Norovirus

Die Plaque Assay-Verfahren für MNV-1 dargestellt ist hier ein Weg zur Quantifizierung infektiösen MNV Teilchen. Durch Befolgen der Schritte Assay in 3 dargestellt, kann man erhalten reproduzierbare viralen Titern. Die Nachweisgrenze des Tests hängt von der ausgehend Verdünnung verwendet. Beim Starten mit einer 1:10 Verdünnung der Probe, wie oben beschrieben, ist die Nachweisgrenze des Plaque-Assay 10 pfu (dh 1 Plaque sichtbar am 10 ^{-1-Verdünnung).} Da jeder Plaque stellt einen einzigen Virus, kann die Plaque-Assay auch zur klonalen Populationen von MNV durch Abheben isolierte Plaques und Propagieren sie wie zuvor beschrieben ¹ zu reinigen. Zusätzlich kann Plaqueaufreinigungen auch verwendet, um eine einzelne Viruspopulation aus gemischten Viruspopulationen abzutrennen. Eine Beschränkung der Verwendung eines Plaque-Assay zum Nachweis von MNV Infektion ist, dass nicht alle Stämme MNV Plaques bilden ^4. Jedoch kann es möglich sein, die überwunden inability einiger MNV-Stämme, die von Tieren isoliert, um Plaques durch serielles Passagieren diese Viren in Gewebekultur ⁷ bilden. Eine Alternative zu dem Plaque-Assay ist, um infektiöse Partikel über die TCID _50-Technik ^{3, 4} zu messen. Dieser Assay quantifiziert die Menge des Virus benötigt, um CPE in 50% der inokulierten Gewebekulturzellen nach Endpunkt Verdünnungen und dauert 1 Woche für MNV ⁴ abzuschließen produzieren. Zusätzlich dazu, dass langsamer als ein Plaque-Assay ist die TCID _50-Test auch nicht so empfindlich (Nachweisgrenze = 200 TCID ₅₀ / ml) auf Grund der Toxizität von Gewebeproben zu RAW 264.7 Zellen ^4.

Obwohl kritischen Schritte im Protokoll über das Protokoll beschrieben wurden, bietet der folgende Abschnitt eine Zusammenfassung zur Fehlersuche zu erleichtern. Der wichtigste Schritt in der Protokoll stellt sicher, dass RAW 264.7 Zellen lebensfähig bleiben während des Assays zur Virusreplikation unterstützen. Dies kannin jeder Stufe des Assays über Lichtmikroskopie beobachtet werden. Zelllebensfähigkeit wird auf zweierlei Weise gewährleistet. Erstens sollte darauf geachtet werden, nicht zu lassen Zellen austrocknen beim Umgang Platten werden. Somit werden die Platten einzeln inokuliert geschaukelt während der Infektion Periode und zu schließen, wenn sie nicht behandelt werden, bleiben. Zweitens Lösungen auf Zellen gegeben sein sollte äquilibriert ~ 37 ° C. Weiterhin ist es von entscheidender Bedeutung für die Gesundheit der RAW 264.7-Zellen, um sie in Medien, die Serum endotoxinarm (<10 EU / ml), die Aktivierung von Zellen begrenzt zu halten. Darüber hinaus haben wir einen höheren Ausfallrate der Plaque-Assay unter Verwendung von Zellen beobachtet, wenn von dem Durchgang 30 oder höher. Obwohl dies wird wahrscheinlich von Labor zu Labor unterschiedlich ist, ist es wichtig, eine positive Kontrolle gehören (zB eine Probe mit einem bekannten viralen Titer), um reproduzierbare Titer zu gewährleisten, vor allem bei höheren Durchgang RAW 264,7 Zellen. Um die Verwendung von höheren Durchgang Zellen zu begrenzen, ist es ratsam, Fläschchen frühen passa einfrierenge-Zellen nach Erhalt der RAW 264,7 Zellen und starten Sie eine neue Kultur aus den gefrorenen Flaschen häufig. Starting over mit niedrigen Durchgang Zellkulturen wird auch hilfreich sein, wenn die Zellen veränderte Eigenschaften, wie Fehler zu haften, Veränderungen in der Zellmorphologie (zB von Runde zu spindly und ausbreiten), oder wenn Mykoplasmen-Kontaminationen festgestellt wurde ausstellen. Ein weiterer wichtiger Punkt, um die Aufmerksamkeit zu zahlen, ist zu gewährleisten, dass Pipettenspitzen zwischen den Proben und während Verdünnungen geändert werden. Dadurch wird sichergestellt, genaue Verdünnungsreihen und verhindern eine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Derjenige Schritt im Protokoll wo dieselbe Pipettenspitze wieder verwendet werden kann, wenn serielle Verdünnungen der gleichen Probe zu den Vertiefungen zugegeben. In diesem Fall, sollte man von den meisten verdünnten Inokulum für die am wenigsten zu starten, und kräftig und Abpipettieren bei der Ausarbeitung eines neuen Verdünnung.

Die Plaque-Assay-Protokoll ist änderbare mehrere Modifikationen. Eine Änderung, die vorgenommen, wenn t werdenhier sind nicht genügend Zellen zum Impfen Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung ist, lediglich einen einzigen Bohrung für jede Verdünnung zu inokulieren. Da jedoch das Inokulum Volumen 0,5 ml, die Zahl der Plaques muss dann um einen Faktor von 2 bis zu pfu / ml normalisieren multipliziert. Die Plaque-Assay kann auch für den Einsatz mit jedem anderen adhärenten Zelllinie, die die Replikation von MNV unterstützen angepasst werden, und dies hat für die murine Mikroglia BV-2-Zelllinie ⁸ beschrieben worden. Andere Modifikationen, die implementiert werden können, sind Anpassungen, die für Plaque-Assay-Protokolle für andere Viren entwickelt beschrieben wurden. Im Falle von MNV, haben die folgenden Änderungen bereits erfolgreich umgesetzt; die Verwendung von Methylzellulose statt Sea Plaque Agarose ⁹ und Färbung der Zellen mit Kristallviolett oder Methylenblau anstelle von Neutralrot ^{10, 11.}

Insgesamt kann dieses Protokoll leicht angepasst je nach Bedarf auf andere Plaque-bildenden Viren zu quantifizieren oder für oth werdener Viren, die lytische Infektionen in RAW 264,7 Zellen verursachen, so dass es ein nützliches Werkzeug, um infektiöse Viruspartikel in der Regel quantifizieren.