Plaque assay voor Murine Norovirus

De plaque assay methode voor het MNV-1 hier gepresenteerde is een manier van kwantificeren besmettelijke MNV deeltjes. Door de assay stappen in fig. 3 verkrijgt men reproduceerbaar virale titers. De detectiegrens van de test afhankelijk van de gebruikte uitgangsmaterialen verdunning. Bij het ​​starten met een 1:10 verdunning van monster zoals hierboven beschreven, de detectiegrens van de plaque assay is 10 pfu (dwz 1 plaque zichtbaar op 10 ^-1 verdunning). Aangezien elke plaque vertegenwoordigt een virus kan de plaque assay worden gebruikt om klonale populaties van MNV zuiveren door plukken geïsoleerde plaques en teeltmateriaal ze als eerder beschreven ^1. Daarnaast kan plaquezuiveringen ook worden gebruikt om een ​​individueel viruspopulatie scheiden van gemengde populaties virus. Een beperking van het gebruik van een plaque assay voor de detectie van MNV infectie is dat niet alle stammen MNV vormen plaques ^4. Het kan echter mogelijk zijn de inabili overwinnenty van sommige MNV stammen, geïsoleerd uit dieren, tot plaques te vormen door serieel passage deze virussen in weefselkweek ^7. Een alternatief voor de plaque assay is het meten van infectieuze deeltjes via de _TCID50 techniek ^{3, 4.} Deze assay kwantificeert de hoeveelheid virus vereist om CPE in 50% produceren voedingsbodem weefselkweekcellen na eindpunt verdunningen en duurt 1 week te vullen voor MNV ^4. Naast het feit dat langzamer dan een plaque assay, de TCID ₅₀ assay is niet zo gevoelig (detectielimiet = 200 _TCID50 / ml) door de toxiciteit van weefselmonsters te RAW 264.7 cellen ^4.

Hoewel kritische stappen in het protocol zijn beschreven in heel het protocol worden de volgende sectie vindt u een overzicht aan trouble shooting vergemakkelijken. De belangrijkste stap in het protocol is dat RAW 264.7 cellen levensvatbaar blijven gedurende de test om virusreplicatie te ondersteunen. Dit kanworden gecontroleerd in elk stadium van de assay via lichtmicroscopie. Levensvatbaarheid van de cellen is gewaarborgd twee manieren. Ten eerste moet erop worden gelet niet te laten cellen uitdrogen tijdens het hanteren van platen. Aldus worden de platen geënt met een tegelijk, geschud gedurende infectie periode en blijven gesloten wanneer ze niet worden behandeld. Tweede oplossingen toegevoegd aan cellen moet geëquilibreerd tot ~ 37 ° C. Verder is het van vitaal belang voor de algehele gezondheid van de RAW 264.7 cellen om ze te handhaven in media die lage endotoxine serum (<10 EU / ml), die de activering van cellen beperkt. Bovendien hebben we waargenomen een hoger percentage mislukkingen van de plaque assay bij gebruik van cellen van passage 30 of hoger. Hoewel dit zal waarschijnlijk variëren van lab tot lab, is het belangrijk om een positieve controle omvatten (bijvoorbeeld een monster met een bekende virale titer) reproduceerbaar titers waarborgen, met name bij gebruik van hogere passage RAW 264.7 cellen. Beperken van hogere passage cellen, is het raadzaam om bevriezing flacons eerste passage cellen na ontvangst van RAW 264.7 cellen en start een nieuwe cultuur uit de bevroren flesjes vaak. Starting over met een lage doorgang celculturen zal ook nuttig zijn wanneer de cellen vertonen veranderde kenmerken, zoals het niet in acht, veranderingen in cel morfologie (bijv. van rond tot spichtig en verspreid), of wanneer mycoplasma besmetting is aangetroffen. Een ander belangrijk punt om aandacht te besteden aan is ervoor te zorgen dat de pipetpunten worden gewijzigd tussen monsters en tijdens de verdunningen. Dit zal zorgen voor nauwkeurige seriële verdunningen en het voorkomen van kruisbesmetting tussen de monsters. De een stap in de protocol waarin dezelfde pipetpunt opnieuw kan worden gebruikt wanneer seriële verdunningen van hetzelfde monster worden toegevoegd aan putjes. In dat geval moet worden uitgegaan van de meest verdunde inoculum op zijn zachtst, en krachtig pipetteren op en neer bij het opstellen van een nieuwe verdunning.

De plaque assay protocol is amendeerbaar verschillende wijzigingen. Een wijziging kan worden gemaakt wanneer thier niet genoeg cellen voor enten putjes in duplo is slechts een goed inoculeren voor elke verdunning. Aangezien het inoculum volume is 0,5 ml, het aantal plaques Vervolgens moet worden vermenigvuldigd met een factor 2 tot normaliseren pfu / ml. De plaque assay kan ook worden aangepast voor gebruik met andere hechtende cellijn die in staat is om replicatie van MNV ondersteunen, en dit is beschreven voor de murine microgliacellen BV-2 cellijn ^8. Andere modificaties die kunnen worden toegepast zijn aanpassingen die zijn beschreven voor plaque assay protocollen ontwikkeld voor andere virussen. Bij MNV zijn de volgende wijzigingen reeds met succes toegepast, het gebruik van methylcellulose plaats van Sea Plaque agarose ⁹ en kleuring van cellen met kristalviolet of methyleenblauw in plaats van neutraal rood ^{10, 11.}

Overall, dit protocol gemakkelijk worden aangepast zoals nodig om andere plaquevormende virussen kwantificeren of voor other virussen die lytische infecties in RAW 264.7 cellen veroorzaken, waardoor het een nuttig instrument om infectieuze virale deeltjes in het algemeen te kwantificeren.