对小鼠诺沃克类病毒的空斑法
概要
在这里，我们描述了一种方法来量化小鼠诺罗病毒（MNV），这是唯一的，有效地复制在细胞培养中的诺罗病毒的感染性颗粒。噬斑分析MNV小鼠的巨噬细胞的趋利用，可适于使用的生物或环境样品，含有MNV。
Abstract
小鼠诺罗病毒（MNV）是诺如病毒属的唯一成员，有效地生长在组织培养1，2。细胞裂解和细胞病变效应（CPE）的过程中观察到MNV-1感染的小鼠树突状细胞或巨噬细胞1。这个MNV-1的属性可以用于量化一个给定的样品中，通过进行空斑测定1感染颗粒的数目。噬斑分析依赖于MNV-1的能力在汇合的单层细胞，它们被称为斑块3裂解细胞，以形成孔。
多种技术可用于检测病毒感染的组织培养，收获组织，临床和环境样品，但不是所有的措施的感染性颗粒的数目（ 例如，定量RT-PCR）。量化感染性病毒颗粒的方法之一是进行空斑测定3，这将在下面详细描述的。对的MNV斑块检测的一种变化是氟escent重点检测，，MNV抗原免疫组化染色在细胞单层4。此法可以更快，因为病毒抗原的表达斑块形成之前。它也是有用的滴定病毒无法形成噬斑。但是，荧光焦点检测超出那些噬斑分析需要额外的资源，如抗体和显微镜计数聚焦形成单位。传染性MNV也可以进行量化，通过确定50％组织培养感染剂量（TCID 50）3。该测定中，测量所需的病毒的量在50％的接种组织培养细胞中通过终点滴定5产生CPE。然而，其检出限为高于一个噬斑分析4。
在本文中，我们描述一个噬斑分析，可以用来有效地确定的数目传染性MNV颗粒中存在的生物或环境样品1，4，6的协议。这种方法是巴sed的10倍系列稀释液，这是用来允许细胞（RAW 264.7小鼠巨噬细胞）接种到单层的的MNV含样品的制备。病毒允许附加到对于一个给定的时间内的细胞单层，然后吸气之前覆盖琼脂糖和细胞培养基的混合物与细胞。琼脂使子代病毒的蔓延到邻近的细胞同时限制扩散到较远的位于细胞。因此，受感染的细胞裂解和在单层的形式孔称为斑块。足够的病毒传播后，斑块成为可见下面的染料，如中性红，亚甲基蓝，或结晶紫染色的细胞与。每个斑块在低稀释液，源于一个感染性的病毒颗粒和它的后代，蔓延到邻近的细胞。因此，计数噬斑的数量，允许一个计算空斑形成单位（PFU）的未稀释的样品3中存在。
Protocol
Discussion
空斑法MNV-1的方法，这里介绍的是量化传染病MNV颗粒的一种方式。通过测定图3中示出的步骤之后，可以得到重现性的病毒滴度。检测测定的极限取决于所用的起始稀释。当如上所述用1:10稀释的样品，开始检测的空斑测定的极限是10 pfu的（ 即，1斑块可见在10 -1稀释）。由于每个斑块代表一个单一的病毒，噬斑分析也可以被用来净化无性系种群MNV采摘孤立的斑块和它们传播如前所述1。此外，也可以使用斑块纯化，以分离单个病毒人口从混合病毒种群。用空斑法为MNV感染的检测的一个限制是，并非所有的的MNV菌株形成斑块4。然而，它可能是能够克服inabiliTY的一些MNV株，从动物中分离，形成斑块，通过连续传代，这些病毒在组织培养7。的噬斑分析的另一种方法是测量通过TCID 50技术3，4的感染性颗粒。该测定中量化所需的病毒的量在50％的接种组织培养细胞中的端点稀释和1周〜为MNV 4完成后产生CPE。除了 慢比空斑测定，TCID 50测定也是不那么敏感（检测限= 200 TCID 50 /毫升）由于组织样本，以RAW 264.7细胞4的毒性。
虽然整个协议在协议的关键步骤，下面的部分提供了一个总结，以方便排除故障。在协议中最关键的一步是确保整个检测，支持病毒复制，RAW 264.7细胞保持活力。这可以在每个阶段的试验中通过光学显微镜进行监测。细胞存活率确保在两个方面。首先，应注意不要让细胞干出来的，而处理板。因此，板接种一次一个，轻摇感染期间，并应该保持关闭时，它们并没有被处理。二，添加到细胞中的解决方案应该是平衡〜37℃此外，它是非常重要的RAW 264.7细胞介质中含有低内毒素血清（<10 EU /毫升），这限制了活化细胞，以维持他们的整体健康。此外，我们观察到细胞时，通道30或更高的故障率较高的斑块检测。虽然这可能会有所不同从实验室到实验室，它是重要的，包括阳性对照，以确保重现性滴度，尤其是当使用较高的通道的RAW 264.7细胞（ 例如，一个样品与公知的病毒滴度）。要限制使用更高的传代细胞，最好是冻结小瓶早期帕萨GE细胞在收到RAW 264.7细胞经常从冷冻瓶，并开始一个新的文化。从低传代细胞培养也将是有帮助的，当细胞表现出改变的特点，如不遵守，细胞形态变化（ 例如从圆形到细长的传播），或已检测支原体污染。另外重要的一点要注意的是，以确保枪头之间改变样品在稀释。这将确保精确的连续稀释，防止样品间的交叉污染。协议，其中可以再次使用相同的移液管尖中的一个步骤是，当相同的样品的系列稀释液添加到井。在这种情况下，应该开始从最摊薄接种至少，大力移液管向上和向下时制定了一个新的稀释。
空斑法协议是可以改变的了若干修改。一个修改型式中，可以当t这里没有足够的细胞接种井一式两份，每个稀释度接种只是单一的。然而，由于接种物的体积为0.5毫升，然后空斑数需要乘以2的因数正常化pfu /毫升。噬斑分析也可以适于与任何其他的贴壁细胞线是能够支持MNV复制使用，这已经描述了小鼠小胶质细胞的BV-2细胞系8。可以实现其它的修改，已经描述了为开发对其他病毒的噬斑分析协议的适应。 MNV的情况下，下面的修改已经被成功实施，使用甲基纤维素，而不是海斑块琼脂糖9，结晶紫染色的细胞或亚甲基蓝的，而不是中性红10，11。
总体而言，该协议可以很容易地被修改为所需的量化其它噬斑形成的病毒或用于超视距ER病毒导致溶骨性感染的RAW 264.7细胞，使其成为一个有用的工具，量化，一般的感染性病毒颗粒。
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢的Wobus实验室为重要的意见和建议。 CEW的实验室工作是由美国密歇根大学的启动资金，职业生涯发展的资助NIH / NIAID区域卓越中心的生物防御和新发传染病研究计划（RCE），五区“大湖的RCE（NIH奖1-U54-AI-057153）和NIH R01 AI080611。 MBG-H。实验免疫学研究院（NIH T32 A1007413-16）和微生物发病的分子机制（NIH T32 A1007528）培训补助金是由美国密歇根大学的。 JBC是由德PessoalCoordenação的AperfeiçoamentoNIVEL的高级（CAPES），巴西利亚，巴西。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM/ High glucose | Hyclone | SH30243.02 |
| 2x MEM | Gibco | 11935 |
| 100x Penicillin and streptomycin | Hyclone | SV30010 |
| 10 mM Non-essential amino acids | Hyclone | SH30238.01 |
| 1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 |
| 200 mM (100x) L-glutamine | Hyclone | SH30034.01 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 |
| Sea Plaque Agarose | Lonza | 50100 |
| Neutral Red 0.33% | Sigma | N2889 |
| 1x PBS | Gibco | 10010 |
| 1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z |
| Model 35 Speed Rocker | Labnet | S2035 |
| Magna Lyser Instrument | Roche | 03358968001 |
| Raw 264.7 cell line | ATCC | TIB-71 |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC |
参考文献
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