JoVE Journal > Biology
概要
Abstract
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Published: December 13, 2012
doi:
10.3791/4287
, , , , ,
1Department of Flow and Image Cytometry,Roswell Park Cancer Institute, 2Flow Cytometry & Cell Sorting Resource Laboratory,University of Pennsylvania , 3SciGro, Inc., 4Department of Pathology and Laboratory Medicine,University of Pennsylvania

概要

الاستخدام الناجح للخلية تتبع الأصباغ لمراقبة وظيفة خلايا المناعة وانتشار يشمل عدة خطوات حاسمة. وصفنا طرق: 1) الحصول على وموحدة مشرق، استنساخه التسمية جي مع الأصباغ الغشاء؛ 2) اختيار fluorochromes وشروط الحصول على البيانات، و3) اختيار نموذج لقياس انتشار الخلايا يعتمد على التخفيف صباغة.

Abstract

الفلورسنت الأصباغ تتبع الخلية، إلى جانب تدفق الخلوي والصورة، هي أدوات قوية لدراسة التفاعلات ومصائر أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر والمجراة. 1-5 على الرغم من أن هناك حرفيا الآلاف من المنشورات باستخدام هذه الأصباغ، وبعض تتبع الخلية الأكثر شيوعا التي تواجهها التطبيقات تشمل رصد:

  1. الجذعية والسلف السكون الخلية، وانتشار و / أو تمايز 6-8
  2. مستضد غشاء نقل يحركها 9 و / أو السلائف تكاثر الخلايا و3،4،10-18
  3. وظيفة خلايا المناعة التنظيمية والمستجيب 1،18-21.

المتاحة تجاريا خلية تتبع الأصباغ تختلف على نطاق واسع في كيمياء وممتلكاتهم مضان ولكن سقوط الغالبية العظمى في واحدة من فئتين استنادا إلى آلية لوضع العلامات على الخلية. "الأصباغ غشاء" الذي تمثله PKH26، هي دهون بدرجة عالية الأصباغ رقسم قبعة ثابت ولكن غير تساهمي في أغشية الخلايا، 1،2،11. "الأصباغ البروتين" الذي تمثله CFSE، هي الأمينية التفاعل الأصباغ التي تشكل روابط تساهمية ثابتة مع البروتينات الخلوية 4،16،18. كل فئة لها مزايا وقيود من صنعها. المفتاح لنجاح استخدامها، وخاصة في الدراسات متعددة الألوان والأصباغ التي تستخدم فيها عدة لتتبع أنواع مختلفة من الخلايا، وبالتالي لفهم القضايا الحاسمة تمكن من الاستخدام الأمثل لكل فئة 2-4،16،18،24.

وشملت البروتوكولات هنا تبرز ثلاثة أسباب مشتركة من النتائج السيئة أو متغير عند استخدام خلية تتبع الأصباغ. وهذه هي:

  1. الفشل في تحقيق وموحدة مشرق، ووضع العلامات استنساخه. هذه هي نقطة انطلاق ضرورية لدراسة أي خلية تتبع ولكنها تتطلب الانتباه إلى المتغيرات المختلفة عند استخدام الأصباغ غشاء من البروتين عند استخدام الأصباغ أو الكواشف التوازن ملزمة مثل الأجسام المضادة.
  2. ملون تألقي مجموعات دون المستوى الأمثل لالثاني / أو عدم إدراج ضوابط التعويض النقدي. تتبع صبغ مضان عادة 10 فبراير – 10 مارس مرات أكثر إشراقا من مضان الأجسام المضادة. ولهذا من الضروري التحقق من أن وجود صبغة تتبع لا يضر القدرة على الكشف عن تحقيقات أخرى قيد الاستخدام.
  3. عدم الحصول على مناسبا مع نماذج البرمجيات الذروة. مثل هذه البرامج تتيح المقارنة الكمية من الردود التكاثري بين مختلف السكان أو المنبهات على أساس تردد السلائف أو المقاييس الأخرى. الحصول على مناسبا، ولكن يتطلب استبعاد القتلى / يموتون الخلايا التي يمكن أن تشوه ملامح تخفيف الأصباغ ومطابقة للنموذج الافتراضات التي تقوم عليها مع خصائص الملف صبغة التخفيف المرصودة.

الأمثلة الواردة هنا توضيح كيف يمكن أن تؤثر هذه المتغيرات النتائج عند استخدام الغشاء و / أو الأصباغ البروتين لرصد تكاثر الخلايا.

Protocol

1. وصفها العام غشاء الخلية مع PKH26 صبغ تعقب (المرجع 25؛ الشكل 1) استخدام تقنية معقمة في الخطوات 1،1 حتي 1،9. إعداد ~ 10 7 الإنسان خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى أو الخلايا الليمفاوية (hPBMC، hPBL) باستخدام طريقة المختبر القياسية مع اضافة تدور النهائي XG 300 إلى تقليل تلوث الصفائح الدموية. إعادة تعليق الخلايا في 10 7 / مل BSA في HBSS +1٪ ومكان على الجليد، وحجز 500 ميكرولتر قسامة (5×10 6 خلايا) لاستخدامها في الخطوة 2. مكان 5×10 6 خلايا (500 ميكرولتر) في أنبوب 12 × 75 مم البولي بروبلين المخروطية. يغسل مرة واحدة مع HBSS مل 3.5. نضح بعناية طاف، وترك ما لا يزيد عن 15-25 ميكرولتر من السوائل المتبقية، ولكن مع الحرص على عدم إزالة الخلايا. استخدام هذا الأنبوب لإعداد تعليق خلية 2X في الخطوة 1.4. خلال الخلية الغسيل في الخطوة 1.2، إضافة 0.5 مل من السيارة مخفف وضع العلامات C (من عدة PKH26GL) إلى 12 × 75 مم أنبوب البولي بروبلين المخروطية. استخدام هذا الأنبوب إلى الإعداديةهي 2X PKH26 الحل في الخطوة 1.5. إضافة 0.5 مل من مخفف السيارة C لوضع العلامات بيليه الخلية غسلها من الخطوة 1.2 ونضح والاستغناء 3-4 مرات للحصول على تعليق خلية واحدة (2X الخلايا). تجنب الإفراط في تشكيل فقاعة والاختلاط، الذي قد يقلل من بقاء الخلية والانتعاش. مباشرة بعد إعداد تعليق خلية 2X في الخطوة 1.4، إعداد 2X (4 ميكرومتر) محلول الصبغة عن طريق إضافة 2.0 ميكرولتر من 1.0 ملي مول الأسهم PKH26 الصبغة في الإيثانول (من عدة PKH26GL) إلى أنبوب C مخفف أعدت في الخطوة 1.3 و لدوامة تفريق بشكل موحد. مباشرة بعد إعداد محلول الصبغة 2X في الخطوة 1.5، ماصة بسرعة 2X التعليق الخلية من الخطوة 1.4 في محلول الصبغة 2X ونضح في وقت واحد والاستغناء 3-4 مرات لتفريق تماما الخلايا في صبغ لا: إضافة صبغة 1،0 ملي مول مباشرة الخلايا؛ تصب في صبغ الخلايا 2X 2X، أو إضافة خلايا 2X 2X لصبغ بينما vortexing. لأن تلطيخ بشكل فوري تقريبا، تسفر عن مثل هذه الأساليب أقلمن شدة موحدة الأسلوب الموصى به (الشكل 2). بعد 1 دقيقة، إضافة 1.0 مل من المصل الحرارة المعطل أو HBSS BSA +5٪ لوقف امتصاص صبغة في أغشية الخلايا. عدم استخدام مخاطر ما يكفي من البروتين في تشكيل المجاميع الصبغة، والتي يمكن بيليه مع الخلايا خلال خطوات الغسيل ووضع العلامات غير المقصودة تسبب الخلايا الأخرى الموجودة في تجربة. إذا المتوسطة مع المصل الحرارة 10٪ المعطل (CM) أو HBSS +1٪ BSA هو أن تستخدم الكاشف توقف، تنفيذ تلطيخ في أنبوب 15 مل المخروطية البولي بروبلين وإضافة ما لا يقل عن 5،0 مل من كاشف لضمان وقف جميع امتزاز غير مدمج صباغة. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المسمى لمدة 5 دقائق @ ~ 400 × ز. نضح بعناية طاف دون إزالة الخلايا. غسل بيليه مرتين مع 4 مل من CM أو HBSS BSA +1٪، تشتيت بيليه جيدا قبل recentrifugation. للحد من المرحل من صبغ الجدران أنبوب كثف على أقصى قدر من الكفاءة والغسيل، ونقل الخلايا إلى أنبوب البولي بروبلين جديدة بعد فايRST إعادة تعليق. ملاحظة: الخلايا الملون بشكل كاف سوف تظهر مسحة متميزة الوردي في بيليه. إعادة تعليق بيليه وغسلها خلية في BSA 1،0 مل HBSS٪ +1. عد الخلايا، وتحديد الانتعاش الخلية، وضبط مستوى الصوت لإعطاء تركيز النهائي من 10 7 / مل. مع التطلع الحذر، يجب أن يكون الانتعاش الخلية ≥ 85٪. إذا استرداد الخلية <70٪، تحديد سبب قبل المضي قدما. سحب 150 ميكرولتر قسامة (1.5×10 6 خلايا) ومكان على الجليد لاستخدامها في الخطوة 2. 2. إعداد الضوابط إعداد الصك والفحص (الجدول 1) قسامة 50 ميكرولتر (5×10 5) من الخلايا غير ملوثين من التعليق الخلية المحفوظة في الخطوة 1.1 في كل من خمسة 1،8 مل أنابيب إيبندورف: 1، 3، 4، 5، و 7. قسامة 50 ميكرولتر (5×10 5) نقاط البيع من الخلايا PKH26 من الخطوة 1.9 في كل من ثلاثة أنابيب: 2 و 6 و 8. إضافة 10 ميكرولتر مفتش كتلة (100 ميكروغرام / أنبوب من مفتش الحكومة، وانظر جدول الكواشف) لأنابيب 1-8واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). إضافة كمية من الأجسام المضادة تشبع (السلطات) المشار إليها في الجدول 1 لأنابيب 4 و 5 و 7 و 8 و احتضان جميع العينات (أنابيب 1-8) لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء. إضافة 1.5 مل من BSA HBSS +1٪ لجميع العينات، بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (5 دقائق @ 400 XG) ويغسل مرة واحدة مع 1.5 مل من HBSS +1٪ BSA، مع التطلع الحذر لتجنب فقدان الخلية. إعادة تعليق كل عينة في 500 ميكرولتر من BSA HBSS +1٪. إذا لزم الأمر للعينات لتحليلها في عداد الكريات الخاص، ونقل إلى أنبوب 12 × 75 مم أسفل الجولة. إضافة 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل 7-AAD اليومية الأسهم العمل (انظر الجدول من الكواشف) لأنابيب 3 و 6 و 7 و 8 على النحو المبين في الجدول 1. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام في قياس التدفق الخلوي الإعداد والتحقق تلطيخ (الخطوة 3). 3. تدفق عداد الكريات الإعداد والتحقق تلوين تحقق من أن تدفق cytomeثالثا تعمل بشكل صحيح، وذلك باستخدام إجراءات المختبر التي أنشئت لمراقبة الجودة اليومية. يمكن التحقق من أن يتم الكشف عن الإشارات بسهولة في كل إطار الطيفية لاستخدامها، وأن الاستجابات تتناسب خطيا كاشف للإشارة إلى شدة في إطار لاستخدامها في رصد انتشار 14 الحصول على مقابل FSC SSC البيانات لأنبوب 1 باستخدام جداول العرض الخطي. ضبط التضخيم كل كاشف لدرجة أن السكان اللمفاويات يقع في الربع السفلي الأيسر من مؤامرة نقطة، ليست خارج نطاق إما في المعلمة، وعدم انقطاع بسبب العتبة. جمع ungated FSC مقابل SSC البيانات لجميع العينات في خطوات 3،3 حتي 3،7. الحصول على البيانات للأنبوب 1، باستخدام أي تعويض اللون والمقاييس لوغاريتمي لعرض جميع أجهزة الكشف عن 4 مضان. ضبط الجهد للكشف عن كل العالية (HV) لوضع تألق ذاتي من الخلايا الليمفاوية غير ملوثين على النطاق مع عدد قليل / لا تراكم الخلايا في القناة الأولى. تعيين الحدود تحليل الرسم البياني لكلالمقابلة ل٪ 2 من ألمع الخلايا غير ملوثين. باستخدام أي تعويض اللون وإعدادات HV أنشئت في خطوات 3.2 و 3.3، الحصول على البيانات للأنبوب 2، جمع FSC، والإشارات SSC في جميع أجهزة الكشف عن 4 مضان. لكشف المستخدمة لرصد PKH26 مضان، تحقق من أن جميع نقاط البيع PKH26 الخلايا تظهر على نطاق والذروة ومتناظرة واحدة في العقد الثالث عشر 3 -4، مع عدم وجود عدد قليل خلية / في قناة الماضي. إذا كان هناك قمم متعددة أو ينحرف شكل الذروة، كرر الخطوة 1 مع الحرص على الاهتمام الملح وتقليل تقنية خلط (الشكل 2). إذا لزم الأمر، وضبط تركيز الصبغة. باستخدام إعدادات أنشئت في الخطوة 3.3، الحصول على بيانات عن أنبوب 3، جمع FSC، والإشارات SSC في جميع أجهزة الكشف عن 4 مضان. لكشف المستخدمة لرصد 7-AAD مضان، تحقق من أن 7-AAD خلايا تقع نقاط البيع فوق الحدود 2٪ التي أنشئت في الخطوة 3.3 (أي أن يتم حل غير قابل للحياة بشكل جيد الخلايامن الخلايا قابلة للحياة NEG 7-AAD). باستخدام إعدادات أنشئت في الخطوة 3.3، الحصول على بيانات عن أنبوب 4، جمع FSC، والإشارات SSC في جميع أجهزة الكشف عن 4 مضان. تحقق من أن يتم حلها بشكل جيد CD8 خلايا من خلايا غير ملوثين نقاط البيع (أي سقوط فوق الحدود 2٪ التي أنشئت في الخطوة 3.3 لكشف FITC). كرر مع أنبوب 5 و التحقق من أن يتم حلها بشكل جيد CD8 خلايا من خلايا غير ملوثين نقاط البيع (أي سقوط فوق الحدود 2٪ التي أنشئت في الخطوة 3.3 لكشف APC). الإعدادات باستخدام أنشئت في الخطوة 3.3، الحصول على البيانات لأنابيب 6 و 7 و 8، وجمع FSC، والإشارات SSC في جميع أجهزة الكشف عن 4 مضان. استخدام الملفات وضع قائمة جمعت للأنابيب 1-5 والبرنامج تعويض اللون لإنشاء اللون تتداخل مصفوفة لكل ملون تألقي في أجهزة الكشف عن المستخدمة لرصد fluorochromes الثلاثة الأخرى. تطبيق هذه المصفوفة إلى قائمة ملف وضع العينة (6) والتحقق من أن وجود مختبر PKH26eling لا يغير من القدرة على الكشف عن خلايا 7-AAD نقاط البيع. تطبيق اللون تتداخل مصفوفة من الخطوة 3.8 إلى قائمة الملفات وضع العينة 7 و تحقق ما يلي: أ) ويمكن تحديد المجموعات السكانية الفرعية 3 حل جيد (CD3 CD4 NEG NEG، CD3 CD4 نقاط البيع POS NEG وCD3 CD4 نقاط البيع) على FITC مقابل APC نقطة مؤامرة، وب) وجود المضادة للCD3-FITC ومكافحة APC-CD4 لا يغير من القدرة على الكشف عن خلايا 7-AAD نقاط البيع. إذا وجود المضادة للFITC-CD3 يغير الحدود العليا لل2٪ على البيانات التي تم جمعها كاشف PKH26، إعادة ضبط الحدود كما هو مطلوب. تطبيق مصفوفة التداخل لون من الخطوة 3.8 إلى قائمة الملفات وضع العينة 8. كأن وجود PKH26 وضع العلامات يغير حدود 2٪ لFITC، 7 AAD أو للكشف عن مجموعة من تلك APC باستخدام عنصر التحكم تألق ذاتي في الخطوة 3.3، إعادة تعديل الحدود (المنشأ) حسب الحاجة باستخدام أنبوب 7 من الجدول (1) وتحقق من أنه لا يزال من الممكن distinguish CD3 CD4 نقاط البيع POS، CD3 CD4 NEG نقاط البيع، وCD3 CD4 خلايا NEG NEG باستخدام الحدود المعدلة (المنشأ). 4. انتشار اختيار نموذج لرصد انقسام الخلايا من التخفيف صبغ تحديد التباعد بين الأجيال، وهو يعتمد على عدد من القنوات وعقود لوغاريتمي على عداد الكريات الخاص بك. بالنسبة للأدوات الرقمية، يتم تحديد هذه القيمة، وعادة 4 أو 5 عقود، من قبل عدد من صناديق في معالج الاشارات الرقمية. على الصكوك التناظرية، حيث بلغ عدد العقود ونادرا ما تكون رقم صحيح، والنمذجة دقيقة تتطلب العدد الدقيق للعقود يتم تحديدها تجريبيا. للقيام بذلك، والحصول على بيانات من خليط من الخرز الفلورسنت معايرة مع الشركة المصنعة تعيين كثافة نسبية في إعدادات كاشف الجهد العالي نفسها التي استخدمت في التجربة. الموقف من قمم حبة يسمح لمعايرة مقياس لوغاريتمي من من حيث كثافة العملياتمجموعة ensity في العقد السجل. على وجه التحديد، ويتم ذلك عن طريق التآمر رقم القناة لكل نوع حبة ضد السجل من القيمة المخصصة الصانع. المنحدر من خط مستقيم أفضل تناسب لقيم البيانات حبة يعطي عدد من الوحدات الكثافة النسبية لكل قناة. مضروبا في عدد من القنوات، وسوف تكون هذه القيمة ثم سجل عدد من العقود للجدول كامل، والتي يمكن حساب عدد من القنوات المقابلة إلى انخفاض شقين في كثافة (أي تباعد ابنة جيل) 14. يقرر ما إذا كان استخدام التباعد بين الأجيال ثابتة أو السماح بتعويم التباعد. وهناك معيار (الثابتة) الإعداد استخدام قيمة تباعد الأجيال تحديدها في الخطوة 4.5 إلى تعيين موقع كل جيل، ويستخدم عادة عند الرسم البياني يفتقر قمم متميزة. A الإعداد يسمح تعويم يحدد كل موقف الذروة في الأجيال شكل الرسم البياني، ويستخدم عادة عند distinguishablقمم ه الأجيال واضحة. يقرر ما إذا كان استخدام عرض الذروة ثابتة لجميع الأجيال أو عرض العائمة. عرض ثابت يستخدم SD المحسوبة لعينة السيطرة unstimulated في تصميم نموذج جميع الأجيال وعادة ما يتم اختيار العينة عندما يفتقر قمم الأجيال مميزة. A عرض العائمة يسمح البرنامج لتختلف بشكل مستقل لكل جيل SD ويستخدم أفضل مع وجود قمم مميزة الأجيال. تشغيل برنامج يحتوي على وحدة تحليل انتشار (LT هنا ModFit الإصدار 3.3). تحميل ملف نقاط البيع حفز PKH26 من مجموعة البيانات التي سيتم تحليلها (على سبيل المثال، وهو حفز ثقافة ساعة 96 من نقاط البيع الخلايا PKH26 counterstained أما الأنبوبة 8 في الجدول 1). تحديد معايير لتحليل، في هذه الحالة PKH26 (585/42) على بوابات قابلة للحياة (7-AAD NEG) CD3 نقاط البيع الخلايا الليمفاوية وFSC مقابل SSC لاستبعاد الحطام والركام الصغيرة الكبيرة (الشكل 3). في تحديدهذه المناطق تكون حذرا لتشمل منطقة عالية مبعثر إلى الأمام حيث توجد عادة الانفجارات ونلاحظ أن التعبير قد يكون CD3 أسفل التضمين في الثقافات حفز. إنشاء نموذج جديد الانتشار باستخدام معالج انتشار الأسلحة النووية. باستخدام ملف بيانات المفتوح (علامة التبويب ابدأ)، تحميل unstimulated السيطرة نقاط البيع PKH26 الملف وتحديد مكان وجود قناة الذروة في توزيع الوالدين الموافق خلايا غير مقسمة. تحليل ملف لمراقبة نقاط البيع unstimulated PKH26، مشيرا إلى القيم الأبوية لموقف الذروة والعرض (الانحراف المعياري). إذا هو المطلوب بعرض الذروة الثابتة (SD)، والتحقق من قفل SD. تحميل PKH26 NEG السيطرة (على سبيل المثال، ثقافة ساعة 96 من خلايا NEG PKH26 counterstained أما الأنبوبة 7 في الجدول 1). ضبط عدد من الأجيال من خلال وضع القناة لذروة الأكثر خفوت جيل فوق عنصر التحكم NEG PKH26. هذا يحدد نوmber الأجيال ابنة النموذج يمكن أن يصلح بدقة وعادة 6-9 أجيال. فتح ملف البيانات لعينة حفز (على سبيل المثال، وحفز ثقافة ساعة 96 من نقاط البيع الخلايا PKH26 counterstained أما بالنسبة تيوب 8 في الجدول 1) وتؤكد أن المناطق لمنصب الذروة الوالدين وSD على النحو المحدد في الخطوة 4.7 دون تغيير. إذا هو المطلوب تباعد الأجيال الثابتة، حدد الخيار نموذج قياسي، واختيار الخيار إلا العائمة. تحليل كل ملف التجريبية في مجموعة البيانات، وذلك باستخدام نفس النموذج المحدد في الخطوة 4.9. تعديلات طفيفة قد لموقف الوالدين الذروة تكون ضرورية لصالح أفضل جدا كما هو محدد من قبل كل من البصر وانخفاض قيمة تشي (RCS) مربع. تسجيل قياسات الانتشار المطلوب الناتجة عن نوبة أفضل لكل ملف التجريبية في مجموعة البيانات. للحصول على وصف شامل للمقاييس ممكن انظر المرجع. 22.

Representative Results

الأصباغ مثل غشاء PKH26 وصمة عار من شبه فورية إلى تقسيم أغشية الخلايا بدلا من التفاعل الكيميائي (لCFSE) أو ملزمة التوازن (عن الأجسام المضادة). فإن الافتقار إلى الانتباه إلى القضايا الحرجة المبينة في الشكل 1 يؤدي إلى تلطيخ قاتمة أو غير المتجانسة من النوع هو موضح في الشكل 2. في المقابل، واستخدام العلامات الظروف الأمثل (الشكل 1، الجدول 2) النتائج في توزيع متجانس مشرق مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك رصد خلية تتبع انقسام الخلايا يعتمد على التخفيف صبغ (الشكل 3). الخلايا الميتة / الموت تفقد كميات مختلفة من الصبغة تتبع، والتي يمكن توسيع و / أو ابنة الجيل شدة الانحراف وانتشار تعقيد النمذجة يعتمد على التخفيف صبغ 3،4،16،18. ولذلك يوصى استخدام صبغة حيوية عند جمع البيانات في ظل ظروف التخفيف الصبغة حيث يمكن مسبقا أعداد كبيرة من الخلايا الميتةأرسلت، مثل حفز الثقافات (الشكل 3) أو أكثر العينات (الشكل 4). لأن تتبع العلامات صبغ يعطي عادة كثافة مضان عدة أوامر من حجم أكبر من المناعي الظاهري، من المهم أن تشمل ضوابط التعويض المناسب (الجدول 1)، والتحقق من وجود تتبع صبغة لا يضعف القدرة على حل خلايا الأجسام المضادة الإيجابية والسلبية (الشكل 4). لتجنب الحاجة إلى تعويض اللون الزائد، فمن الأفضل لوضع ملون تألقي مشرق، أو واحد لم يتم العثور على خلايا ذات الأهمية مثل صبغة استبعاد من قبل خلايا حية، في القناة الطيفية (ق) المتاخمة للصبغة تتبع (الشكل 4A & B مباراة. 4C & D). عند استخدام برامج النمذجة الذروة لتحديد مدى انتشار، والحصول على مناسبا يتطلب افتراضات مطابقة ضمن نموذج لخصائص الأستاذ تخفيف الصبغةيجري تحليل ديزيل (الشكل 5 والجدول 3). مع اختيار المناسب من الأصباغ تتبع والكواشف الجدوى، فمن الممكن أيضا أن تميز استجابات اللمفاويات التكاثري فى فئة متعددة في نفس الوقت. على سبيل المثال، كما هو موضح في الشكل 6، إضافة صبغة تتبع 2 يبسط التمييز بين الخلايا T التنظيمية (المسمى مع كلاريت CellVue) وتكاثرت جدا المستجيب خلايا T (المسمى مع CFSE) ويقدم تفاصيل أكبر بكثير عن تفاعلاتها من الممكن أن يحصل باستخدام 3 H-ثيميدين وضع العلامات 18،27. الشكل 1. بروتوكول العامة لوضع العلامات غشاء PKH67، والأصباغ PKH26 CellVue. تقسيم هذه الأصباغ دهون بدرجة عالية في خلية الاغشيهغير مذكورة ولا داخلة يحدث أساسا في الحال عند الاختلاط مع الخلايا عندما يتم تلطيخ في السيارة خالية من الملح C مخفف المقدمة إلى تحقيق أقصى قدر من الكفاءة والقابلية للذوبان صبغة تلطيخ. على النحو الموجز في هذا التخطيطي لوضع العلامات غشاء العام مع PKH26، ومشرق، وتلطيخ موحدة وقابلة للتكرار وبالتالي أكثر سهولة الحصول عليها عن طريق: 1) التقليل من كميات من البروتين و / أو الأملاح الموجودة في خطوة وتلطيخ 2) باستخدام تقنية الخلط الذي يؤمن متجانسة تشتت السريع لخلايا الصبغة في (أي في وقت واحد يعرض كل الخلايا لنفس تركيز صبغة). الشكل 2. تأثير الظروف على تلطيخ PKH26 توزيعات مضان (نقلا عن المرجع 18). تكرار عينات من U، وتزايد غاريثمي مثقفكانت ملطخة الخلايا مع 937 PKH26 (تركيزات النهائي: 1 × 10 7 خلية / مل، 12 – 15 ميكرون PKH26) لمدة 3 دقائق عند درجة حرارة الغرفة، مع أو بدون خلط فوري على إضافة خلايا 2X 2X لصباغة. بعد الغسيل، وقد تم تحليل الخلايا الملون على عداد الكريات بيكمان كولتر تدفق سماوي باستخدام إعدادات أداة المدرج التكراري المستمر 1: السيطرة غير ملوثين مع الجهد للكشف عن PKH26 تعديلها لوضع كافة الخلايا على نطاق في العقد الأول مع عدد قليل / لا تراكم الخلايا في القناة الأولى. الرسم البياني 2: تلطيخ في صبغ ميكرومتر 15 باستخدام الخلايا إضافة إلى 2X 2X مع صبغة خلط فوري أدى إلى الملون، ومشرق متجانس، والسكان من الخلايا المتماثلة وضعت في العقد الرابع، مع عدد قليل / لا تراكم الخلايا في آخر قناة (gMFI = أدى تلطيخ في صبغ ميكرومتر 15 باستخدام الخلايا إضافة إلى 2X 2X الصبغة لكن دون الخلط المباشر في انخفاض كثافة وأوسع CV (gMFI = 505:. 2548، GCV = 26.2٪) الرسم البياني 3 ، GCV = 116٪)، وكذلك جزء من السكان الملون بشكل خافت، وربما يعود ذلك إلى انخفاض الخلايا الاستغناء على جدار الأنبوب بدلا من محلول الصبغة في 2X الرسم البياني 4: أدى خطأ تلطيخ إلى 3 ميكرولتر من الايثانول صبغة مركزة. يتم إضافة الأسهم مباشرة إلى الخلايا في 2X C مخفف دون مزيد من الخلط بدلا من أن تستخدم لإعداد محلول الصبغة في 2X C. مخفف هذا أدى إلى تركيز الصبغة النهائية من 12 ميكرومتر ولكنه خافت للغاية وتلطيخ غير المتجانسة (= 32،9 gMFI، GCV = 1020٪). لاحظ الانحراف الحق الأرجح يعكس الآثار المجتمعة لل: ط) الفقراء بسبب الاختلاط خلية متباينة على نطاق واسع وأحجام صبغة؛ والثاني) حقيقة أن يتعرض الخلايا الأقرب إلى نقطة الاستغناء الصبغة إلى تركيز أعلى من صبغة أبعد من تلك التي بعيدا. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية . إعادة 3 "SRC =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg "FO: المحتوى العرض =" 4.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/> الشكل 3. استخدام مسبار الجدوى يبسط النابضة لمحات تكاثر الخلايا T وصفت hPBMC مع PKH26 (تركيز النهائي الخلية: 3×10 7 / مل؛ تركيز الصبغة النهائية: 10 ميكرومتر). بعد 96 ساعة من أجل الثقافة في وجود (حفز) أو غياب (unstimulated) من CD3 المضادة للطائرات وIL-2، كانت counterstained الخلايا المضادة للFITC-CD3، ومكافحة CD19-APC و 7 AAD، وحللت على FACSCalibur تدفق عداد الكريات (انظر المرجع (13) لمزيد من التفاصيل). تم إجراء تعويض اللون في وقت الحصول على البيانات باستخدام ماثلة الدوائر التعويض. كان على غرار مدى انتشار كما هو موضح في الخطوة 4 باستخدام معالج انتشار في ModFit LT3.3. ومضافين البيانات من السيطرة NEG PKH26 (الجدول 1، أنابيب 7) للرجوع إليها (رمادي المدرج الاحصائي شغلها في العمود 3). Viabilities لunstimulated والأمراض المنقولة جنسياكانت الثقافات mulated 76٪ و 62٪ (بيانات ungated لوحات A و B على التوالي). لوحة A. PKH26 الخلايا المستزرعة الملون لمدة 96 ساعة في المتوسط ​​كانت بوابات لتشمل قابلة للحياة (7-AAD NEG) CD3 نقاط البيع الخلايا (R1). بالإضافة إلى إدراج الأجسام المضادة و7-AAD استبعاد الخلايا الميتة بوابة، مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) بوابة (R2) كان يستخدم لاستبعاد الحطام والركام. لاحظ عدم وجود الخلايا الميتة في المؤامرة الأخيرة في هذه اللوحة. وقدم أفضل نموذج صالح لملف التعريف انتشار PKH26 (العمود 3) ذروة واحدة مع التماثل = 2.1 (المانحة 6، الجدول 3)، مشيرا إلى RCS جيدة، وكان يستخدم لتحديد موقف الوالدين وبدء عرض الذروة لتحليل حفز عينة من هذه المجموعة البيانات (لوحة B). لوحة B. ومثقف A قسامة من تكرار PKH26 الخلايا ملطخة CD3 المضادة للطائرات و2-IL لمدة 96 ساعة وبوابات بنفس الطريقة كما هو الحال في لوحة نموذج A مع موقف الذروة العائمة A. وقدم العرض العائمة الذروة الأنسب لهذه البيانات مع C. وحة RCS = 1.3 (المانحة 6، الجدول 3). ملف البيانات نفسها كما في لوحة تم تحليل A من دون استخدام 7-AAD البيانات. وظل عدد صغير من السكان المتبقية من الخلايا الميتة عندما تم استخدام الأولية FSC مقابل SSC لاستبعاد الخلايا الميتة وجزئيا المجاميع (R2) وبوابة الثانوية لتحديد CD3 الأحداث الإيجابية (R3)، (0.2٪ من الأحداث بوابات). وقدم أفضل نموذج صالح ذروة واحدة مع RCS = 2.2. لوحة D. ملف البيانات نفسها كما في لوحة B كان بوابات كما هو الحال في لوحة C. لاحظ أكبر من السكان المتبقية من الخلايا الميتة في العينة حفز (1.29٪ من الأحداث بوابات) لهذه الاستراتيجية النابضة. وكان أفضل نموذج صالح واحد مع موقف الذروة العائمة والعائمة عرض الذروة (RCS = 1.3). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية . ig4.jpg "FO: المحتوى العرض =" 5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/> الشكل 4. تأثير الخيار ملون تألقي والتركيز على صبغ الخلايا الليمفاوية القدرة على نمط ظاهري مناعي المسمى مع PKH26. تم عزل hPBMC من 24 ساعة في الدم القديمة والمسمى مع PKH26 كما هو موضح في الخطوة 1، مع الاستثناء الذي أجري في تلطيخ 12 × 75 مم أسفل الجولة البوليسترين أنابيب أنابيب بدلا من 12 X 75 مم البولي بروبلين المخروطية. مباشرة بعد وضع العلامات مع PKH26، كانت counterstained الخلايا مع الكواشف المشار immunophenotypic وقدرتها على البقاء، وتحليل تدفق عداد الكريات على LSRFortessa باستخدام استراتيجية النابضة من الشكل 3A والتكوين التالية البصرية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)؛ SSC -A (488/10 BP)، FITC-A (530/30 BP)؛ PKH26-A (575/26 BP)؛ 7-AAD-A أو A-PerCP (695/40 BP). 640 نانومتر ليزر: APC-A أو TOPRO-3-A (670/14 BP). تم إجراء تعويض اللون في وقت الحصول على البيانات باستخدام BD المغنية البرمجيات. "السيارات"يشير تألق ذاتي للتحكم في عدم الضد الطيفية ذات الصلة النافذة (APC لوحات A و B، C PerCP للألواح وD). ومضافين البيانات من السيطرة NEG PKH26 (الجدول 1، أنابيب 7) للرجوع إليها (رمادي المدرج الاحصائي شغلها، العمود 5). وبعد تلطيخ viabilities مماثلة لجميع العينات (88-92٪). لوحة خلايا A. المسمى مع PKH26 عند تركيز النهائي من 2 ميكرومتر كانت counterstained استخدام الألغام المضادة للCD3-FITC، ومكافحة CD4-APC، و7-AAD ( 8 من أنبوب الجدول 3). بعد النابضة على قابلة للحياة (7-AAD NEG) CD3 الخلايا الليمفاوية نقاط البيع (العمود 1) والاستبعاد من الحطام والركام وبناء على FSC SSC (انظر الشكل 3A)، تم تقييم شدة PKH26 بالاشتراك مع CD4 APC (أعمدة 2 و 3). سواء بدون تعويض (العمود 2) أو تعويض (عمود 3)، وهذا أدى إلى مزيج ملون تألقي قرار جيد CD4 T بين الخلايا CD4 الخلايا ونقاط البيع NEG T)، التحقق على حد سواء من قبل أي واحدntibody، ومراقبة autofluorescent (أنبوب 6 من الجدول 1؛ العمود 4) والمؤامرة اللونين من مباراة CD3. لم CD4 (العمود 6). لوحة B. باستخدام نفس تركيبة ملون تألقي كما في لوحة A، ولكن زيادة تركيز النهائي PKH26 إلى 4 ميكرومتر لا تؤثر سلبا على القدرة على حل نقاط البيع CD4 T خلايا CD4 T من الخلايا NEG. لوحة C. A وcounterstained قسامة من الخلايا تكرار المسمى بشكل مستقل مع PKH26 عند تركيز النهائي من 2 ميكرومتر استخدام الألغام المضادة للCD3-FITC، ومكافحة CD4-PerCP، وTOPRO 3-. بعد النابضة على قابلة للحياة (TOPRO-3 NEG) الخلايا اللمفية CD3 نقاط البيع (العمود 1) والاستبعاد من الحطام والركام وبناء على FSC SSC (انظر الشكل 3A)، تم تقييم شدة PKH26 بالاشتراك مع مكافحة PerCP-CD4 (أعمدة 2 و 3). التداخل الطيفي كبير من PKH26 في القناة PerCP هو واضح في البيانات بدون تعويض (العمود 2)، والقرار بين CD4 نقاط البيع PKH26 <suف> نقاط البيع POS وPKH26 CD4 الأحداث NEG هامشية بعد تطبيق التعويض (قارن مع العمود 3 السيطرة، لا الأجسام المضادة autofluorescent المبينة في العمود 4). لوحة D. عندما يزداد تركيز PKH26 إلى 4 ميكرومتر، فإنه لم يعد ممكنا لاستخدام مزيج ملون تألقي التداخل الطيفي لوحة C. من PKH26 في القناة PerCP يتجاوز شدة الإشارة من CD4 (العمود 2) وCD4 لم تعد قادرة على نقاط البيع POS PKH26 الأحداث يمكن حلها من CD4 NEG PKH26 نقاط البيع خلايا T (العمود 3 مباراة. عمود 4). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية . الشكل 5. تأثير الانتشار على اختيار نموذج. صلاح صالح للتخفيف الصبغة ملامح وصفت hPBMC مع PKH26 (تركيز النهائي الخلية: 3×10 7 / مل؛ تركيز الصبغة النهائية: 10 ميكرومتر). بعد 96 ساعة من أجل الثقافة في وجود (حفز) أو غياب (unstimulated) من CD3 المضادة للطائرات وIL-2، كانت تحصد الخلايا counterstained مع المضادة للCD3-FITC، ومكافحة APC-7-CD19 وعاد وتحليلها على FACSCalibur قياس التدفق الخلوي (انظر المرجع 13 للطرق مفصلة). تم إجراء تعويض اللون في وقت الحصول على البيانات باستخدام ماثلة الدوائر التعويض. لوحة A. كان الملف كثافة PKH26 من ثقافة unstimulated ساعة 96 لمتبرعين 5، مستجيب المعتدلة، كما هو مبين في بوابات 3A الشكل وتستخدم لتوفير انتشار ModFit تم تحليل المعالج مع تقدير الموقف الأول من العرض وللذروة التي تمثل الخلايا الأبوية غير مقسمة. لوحة B. وشدة الشخصي PKH26 من 96 ساعة موازية حفز ثقافة استخدام التقديرات بدءا منالفريق و 4 مجموعات مختلفة من الإعدادات "انتشار معالج '، الموافق شدة ذروة ثابتة أو عائمة، وعرض ثابت أو عائم الذروة للأجيال المتعاقبة ابنة كما هو موضح. على النحو الموجز في الجدول 3، النموذج الذي أعطى الأنسب للبيانات المرصودة (أدنى انخفاض خي مربع؛ RCS) كان "عائم / العائمة" تركيبة سمح فيها ليس فقط ولكن أيضا مواقف الذروة الانحرافات المعيارية من قمم الجيل ابنة أن تختلف (RCS = 1.5). أعطى نفس النموذج الأنسب للمتبرعين 6، مستجيب عالية (الشكل 3B والجدول 3). الشكل 6. إضافة صبغة خلية تتبع 2 يبسط التمييز بين الخلايا T المستجيب والتنظيمية في قمع فحص تدفق cytometric(مقتبس من المرجع 18) كانت ملطخة الخلايا الليمفاوية الوحيدات المنضب المحضرة من المرشحات فصادة الكريات البيض TRIMA مع المضادة للPE-CD127، ومكافحة CD4-PE-Cy7، ومكافحة CD25-APC وتدفق سكان مصنفة في تيف (المستجيب؛ CD4 نقاط البيع CD127 CD25 مشرق قاتمة) والتنظيمية (Treg؛ CD4 نقاط البيع POS CD127 CD25 قاتمة)، والتبعي (CD4 NEG) الخلايا. كانت الخلايا Treg مصنفة المسمى مع كلاريت CellVue (تركيز النهائي الخلية: 1×10 6 / مل؛؛ تركيز الصبغة النهائية: 1 ميكرومتر) وتيف مصنفة المسمى مع CFSE (تركيز الصبغة النهائية، 5 ميكرومتر 5 × 10 7 / مل تركيز النهائي الخلية) شارك في تربيتها في نسب متفاوتة في وجود خلايا الإكسسوارات المضادة للCD3، ومكافحة CD28 والمشع. أنجز بعد 96 ساعة، وتحصد الثقافات، counterstained مع المضادة للCD4-PE-Cy7 والعيش / DEAD البنفسج قابل للتثبيت، وتحليل تدفق عداد الكريات على LSRII والتعويض لون في وقت acquisitio البياناتن استخدام BD المغنية البرمجيات (انظر المرجع 18 للتفاصيل بما في ذلك الضوابط التعويض). وعلى غرار لمؤشرات انتشار لتيف وTreg كما هو موضح في الخطوة 4، وذلك باستخدام معالج انتشار في ModFit LT3.3. نقاط البيانات في لوحات B C وتمثل يعني ± 1 الانحراف المعياري لعينات ثلاث نسخ وتظهر بيانات لوحة الممثل A. لمدة ثلاث نسخ من العينات الثلاثة في Treg: نسبة 0.25:1 تيف من المنظمة. وقد استخدم لايف / DEAD كاشف البنفسج قابل للتثبيت لاستبعاد الخلايا الميتة (، R1 مؤامرة العليا اليسرى الخلايا الحمراء التبعي = البني، الرمادي = تيف غير قابل للحياة وغير قابل للحياة Treg الحمراء =) من جميع المؤامرات البيانات الأخرى. وقد استخدم CellVue تلطيخ كلاريت للتمييز Treg قابلة للحياة (R4، مركز مؤامرة الحق؛ الأزرق) من قابلة للحياة ولكن انتشرت جدا تيف (R5، مركز مؤامرة الحق؛ الأخضر). ولدت A CFSE معلمة واحدة لانتشار الشخصي تيف (مؤامرة اليسرى السفلى) بواسطة النابضة على الخلايا التي كانت نقاط البيع CFSE (R5)، CD4 نقاط البيع (R3) وقابلة للحياة (وليس R1)، وكان اللمفاويات SCخصائص atter (R2). ولدت A CellVue معلمة واحدة كلاريت الملف الشخصي للانتشار Treg بواسطة النابضة على الخلايا التي كانت CellVue نقاط البيع كلاريت (R4)، CD4 نقاط البيع (R3) وقابلة للحياة (وليس R1)، وكان مبعثر خصائص الخلايا اللمفاوية (R2). لاحظ المنطقة اللمفاويات سخية (R2) محددة بحيث تشمل التفجيرات اللمفاويات. نلاحظ أيضا أن العدد الإجمالي للخلايا التي يتعين جمعها تعتمد على السكان أقل تردد في المصالح. وينبغي في زنزانة التجربة الانتشار حيث يمكن توزيعها على السكان في المصالح بشأن مجموعة واسعة من شدة يمثلون ما يصل الى سبعة أو ثمانية أجيال على عدد كبير من الخلايا يتم جمعها من أجل تصميم نموذج بدقة وحساب عدد الخلايا في كل جيل. عند دراسة خلايا نادرة، قد يكون من الضروري لتشغيل الأنبوب ببساطة عينة جافة تقريبا من أجل جمع أكبر عدد ممكن من الأحداث. للعينة هو موضح هنا، القيام بذلك أدى إلى ما مجموعه 25000 ~ الأحداث، منها 11923 وتيف (انتشار Iكانت ndex 3.85) و1380 Treg (1.83 مؤشر انتشار). لوحة B. وكما كان متوقعا، مما يزيد من نسبة Tregs الحالي في الثقافات المشتركة أدت إلى مزيد من قمع تكاثر الخلايا تيف. تم الحصول على نتائج مشابهة مع كل من CellVue (الخط المتواصل) كلاريت الملطخة أو غير ملوثين Treg (خط متقطع)، مشيرا إلى أن تلطيخ مع الصبغة كلاريت CellVue تتبع لم يؤثر Treg رجولية. لوحة C. Treg هي التعطيلي نسبيا، وكما هو متوقع، لم لا تتكاثر عندما حضنت مع المضادة للCD3، CD28 المضادة، والخلايا التبعي في غياب الخلايا تيف (Treg: تيف نسبة 1:0). لكن، وكما أن نسبة تيف الحالي في الثقافات المشتركة زيادة (أي، كما Treg: تيف نسبة انخفاض)، ومدى انتشار Treg زادت أيضا. أشرطة الخطأ أكبر عموما لهذه البيانات جزئيا على الأقل تعكس إلى حد محدود الانتشار، مما يؤدي إلى عدد أقل من الأحداث التي جمعت نسبة إلى تيف وزيادة غير مؤكدTY في نمذجة عدد الخلايا في كل جيل. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية . أنبوب رقم (الغرض) PKH26 الأجسام المضادة (المنشأ) 7-AAD 1 (الإعداد، والتعويض) – – – 2 (إعداد والتعويض) + – – 3 (إعداد والتعويض) – – + 4 (التعويض) – CD8-FITC ب – 5 (التعويض) – CD8-APC ب – 6 (أي سيطرة أ ب) + – + 7 (لا الاشتراكات صبغ تتبعالمحول المتعدد العادي) – CD3-CD4-FITC APC-CD19 أو ج APC + 8 (T0 التحكم) + CD3-CD4-FITC APC-CD19 أو ج APC + الجدول 1 إعداد صك يسيطر على عناصر تحكم سرد مناسبة ل4-T لون الخلية CD4 مقايسة رصد انتشار استخدام:. PKH26 (انتشار صبغة)، CD3-FITC (PAN-T علامة الخلية)، APC-CD4 (T-المساعد خلية علامة)، 7-D aminoactinomycin (7-AAD؛ القتلى استبعاد الخلية) ب أكثر إشراقا لعملائها FITC-CD3 CD4 وAPC-(أفضل القدرة على اكتشاف الأخطاء التعويض) ج الشكل 3:. CD3-FITC وCD19 APC. الشكل 4 د: CD3-CD4 FITC وAPC. خلية نوع خلية تركيز النهائي صبغ تركيز النهائي </STRONG> مرجع ب hPBMC 1 × 10 7 / مل 2 ميكرومتر PKH67 10،17 5 × 10 6 / مل 2 ميكرومتر PKH26 12 3 × 10 7 / مل 10 ميكرومتر PKH26 13 5 × 10 7 / مل 30 ميكرون PKH26 18 1 × 10 6 / مل 1 ميكرومتر كلاريت CellVue ج 18 3 × 10 7 / مل 4 كلاريت CellVue ميكرومتر 13 5 × 10 7 / مل 5 ميكرومتر كلاريت CellVue 18 الخلايا في الثقافة 5 × 10 5 / مل 0،1 ميكرومتر PKH26 (1 ° الخلايا الثديية) 8 1 × 10 7 / مل 15 ميكرون PKH26 (U937) 18 1 × 10 7 / مل 12.5 -15 ميكرومتر PKH26 (U937) 15 1 × 10 7 / مل 1 ميكرومتر PKH67 (K562) 18 1 × 10 7 / مل 1 ميكرومتر PKH67 (خطوط الخلايا T) 9 1 × 10 7 / مل 10 كلاريت CellVue ميكرومتر (YAC-1) 23 الجدول 2. غير الاقلاق الشروط تلوين غشاء صبغ لأ. مقتبس من المرجع وتحديثها 18. ب تم استخدام غسيل سرعة منخفضة (300 XG) للحد من التلوث الصفائح الدموية. ج Treg الخلايا (CD4 تدفق مصنفة نقاط البيع POS CD127 CD25 الخلايا الليمفاوية NEG). نموذج إعدادات <td colsعموم = "6" النتائج موديل السيارة> المانح علاج المركز الذروة SD الوظيفة الأبوية الوالدين SD # من قمم مزودة RCS PI PF 5 Unstimulated الطفو الطفو 209 4.5 1 5.1 1.0 0 5 حفز ثابت ثابت 209 <td> 4،5 7 35 3.9 31 5 حفز الطفو ثابت 209 4.5 8 19 4.3 30 5 حفز ثابت الطفو 209 9.2 6 1.9 3.8 30 5 حفز الطفو الطفو 209 تسعة 7 1.5 3.7 29 6 Unstimulated الطفو الطفو 205 4.0 1 2.1 1.0 0 6 حفز ثابت ثابت 205 4.0 6 42 6.6 60 6 </td> حفز الطفو ثابت 205 4.0 7 12 7.4 60 6 حفز ثابت الطفو 205 8.6 6 6.9 6.8 62 6 حفز الطفو الطفو 205 6.5 6 1.3 6.5 59 الجدول 3. تأثير على انتشار الموديل الخير من صالح (RCS) والقياسات انتشار أ. لتلطيخ نموذج جمع البيانات، وتبوب كما هو موضح في الشكل 3A & B.

Discussion

الأساليب المذكورة هنا هي تلك التي وجدت في مختبراتنا المشتركة لمعظم موثوق تعطي أفضل النتائج لوضع العلامات باستخدام الأصباغ hPBMC غشاء 13،16،18 وphenotyping فرعية تتبع انتشار الخلايا اللمفاوية والغشاء أو باستخدام الأصباغ البروتين 2،11،13،16، 18. كما هو موضح في الشكلين 1 و 2، هو الأكثر بسهولة تحقيق وضع العلامات موحد مشرق عن طريق الحد من وجود الأملاح والفسيولوجية باستخدام تقنية الخلط الذي يؤدي إلى التعرض، متجانسة السريع لجميع الخلايا لنفس التركيز من الصبغة. لأن تلطيخ مع الأصباغ الغشاء يحدث من قبل في تقسيم طبقة ثنائية المادة الدهنية، يمكن أن المتغيرات الأخرى التي تغير تركيز صبغة مجانا يؤثر أيضا وضع العلامات كفاءة. على سبيل المثال، ووضع العلامات في أسفل الجولة البوليسترين أنابيب النتائج في تبييض أقل كفاءة من الأملاح قبل إعادة تعليق في C مخفف وأيضا في خفض تركيز صبغة مجانا نظرا لصبغ الامتزاز على جدران الأنبوب، ولا سيمابتركيزات أقل صباغة. كل العوامل تميل إلى إعطاء توزيعات أوسع من تلطيخ عندما يتم وضع العلامات باستخدام أنابيب البولي بروبلين أسفل المخروطية (أرقام 3 و 4 و غير منشورة النتائج). يمكن العمر ونوع العينة تؤثر أيضا عرض الذروة حتى عندما يتم استخدام إجراءات تلطيخ الأمثل. على سبيل المثال، السير الذاتية لنقاط البيع PKH26 الخلايا الليمفاوية المعزولة من الدم المسحوبة مجموعة طازجة من 14-20٪ (الشكل 3، المرجع 13 و نتائج غير منشورة) في حين السير الذاتية لمفاوية معزولة عن 24 عينة الدم ساعة قديمة أو مجموعة الفلاتر TRIMA فصادة 25-30 ٪ (الشكل 4 والمرجع 18).

تلطيخ التوحيد وإلى أي مدى يمكن استبعاد غير قابلة للحياة الخلايا من كلا تحليل ما إذا كانت تؤثر على قمم ابنة مميزة واضحة في تخفيف الصبغة الشخصي، وهذا بدوره يؤثر على اختيار نموذج الانتشار لاحتواء البيانات المرصودة (أرقام 5 و 6 </strong>). على الرغم من أن يستخدم ModFit (فيرتي برمجيات البيت، Topsham، ME) هنا كمثال على البرمجيات المستخدمة لتوليد المقاييس مثل مؤشر الانتشار والتردد السلائف (أرقام 3 و 5 و 6؛ الجدول 3)، وحزم البرمجيات الأخرى تحتوي أيضا على وحدات لتحليل بيانات الانتشار. وتشمل هذه FCSExpress (دي نوفو البرمجيات، لوس أنجلوس، CA) وFlowJo (شجرة نجوم، وشركة، آشلاند، OR). كل هذه البرامج استخدام غير الخطية تحليل المربعات الصغرى للعثور على تكراري الأنسب للبيانات الخام عن طريق تغيير الموقف، وارتفاع SD (أو العرض) من قمم جاوس تمثل أجيال متتابعة ابنة. مؤشر التكاثري (PI) والتردد السلائف (PF) هي التدابير الأكثر استخداما من مدى الانتشار. PI، على النحو المحدد من قبل ModFit، هو مقياس للزيادة في عدد الخلايا على مدى الفحص، قياسا إلى "مؤشر التحفيز" لفحص امتصاص ثيميدين. PF إرجاع جزء من الخلايا الأولية في populatأيون التي ردت على التحفيز المتكاثرة. وينصح الحذر، ومع ذلك، عند قراءة الأدب منذ المصطلحات تختلف إلى حد ما بين حزم البرامج (على سبيل المثال، وFlowJo ModFit استخدام تعاريف مختلفة وحسابات ما هو المقصود ب "مؤشر انتشار") 22.

واجهت أيضا القضايا الحرجة التي تمت مناقشتها هنا لوضع العلامات وتحليل انتشار الأصباغ مع الغشاء عند استخدام الأصباغ البروتين. على سبيل المثال، يجب أيضا الاهتمام الدقيق لتقنية خلط يتعين مراعاتها، جنبا إلى جنب مع استبعاد الخلايا الميتة / الموت، من أجل الحصول على توزيعات موحد وقمم ابنة مميزة عند استخدام CFSE (الشكل 6) 2-4،13،18،24. الاختيار المناسب للfluorochromes لphenotyping وتقييم الجدوى المهم أيضا تجنب التداخل الطيفي المفرط وعدم القدرة على الاعتراف خلايا الجسم المضاد إيجابية، لا سيما فيما مرئية الأصباغ البروتين ينبعث منها مثل CFSE 2-4،11،13،16،18 </sup>. الحد من تركيز صبغة تتبع يقلل المشاكل التعويض في قنوات الطيفية المجاورة ولكن يحد أيضا من عدد من الانقسامات الخلوية التي يمكن رصدها قبل خلية ابنة شدة تبدأ تتداخل مع تألق ذاتي. بدلا من ذلك، استخدام الأصباغ أحدث خلية تتبع مثل كلاريت ينبعث منها CellVue الحمراء بعيدة (سيغما الدريخ، سانت لويس، MO) أو البنفسجي ينبعث منها CellTrace البنفسج (الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك) قد يقلل المشاكل التعويض (الشكل 6). وأخيرا، على الرغم من الأصباغ الغشاء تميل عموما أقل سمية لعرض 11،26، فمن الممكن أن الإفراط في تسمية الخلايا مع صبغة إما فئة من. ولذلك فمن الضروري دائما للتحقق من أن تركيز صبغة المستخدمة تتبع لم يغير وظائف الخلايا لتعقبها (الشكل 6) 3،13،16،18.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would particularly like to thank the following individuals for their technical and intellectual contributions to the development of these methods through the years: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research), Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), and Mary Waugh (Dartmouth Medical School). They would also like to thank the Bowdoin class of 2006 from the Annual Courses in Research Methods and Applications of Flow Cytometry, which generated the data shown in Figure 2.

Flow cytometry was performed at Roswell Park Cancer Institute’s Flow Cytometry Laboratory, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from the Core Grant (5 P30 CA016056-29) from the National Cancer Institute to the Roswell Park Cancer Institute, and at the Abramson Cancer Center Flow Cytometry and Cell Sorting Resource Laboratory of the University of Pennsylvania, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from NIH #2P30 CA016520 from the National Cancer Institute. The work shown in Figures 3 and 5 was also supported in part by SBIR grant EB00228 from the National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) awarded to PTI Research, Inc.

Materials

Reagent or equipment Company Catalogue number コメント
      Commercially Purchased
7-Aminoactinomycin D Sigma-Aldrich A9400  
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503  
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150  
Hanks balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14175-079 Calcium and magnesium free, without phenol red
Human IgG Cohn fraction II and III globulins Sigma-Aldrich G-4386  
Mouse anti-human CD3-FITC BD Biosciences 349201 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-APC BD Biosciences 340672 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-PECy7 BD Biosciences 348799 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-FITC BD Biosciences 347313 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-APC Caltag (Life Technologies) MHCD0805 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD19-APC Caltag (Life Technologies) MHCD1905 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD25-APC BD Biosciences 340938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD127-PE BD Biosciences 557938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD3 eBiosciences 16-0037-85 1.0 mg/ml; azide free
Mouse anti-human CD28 eBiosciences 16-0289-85 1.0 mg/ml; azide free
PBS Gibco 21300-058  
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
or
MINI26-1KT		 Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT  
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) Invitrogen (Life Technologies) C34554 Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)
LIVE/DEAD Fixable Violet Invitrogen (Life Technologies) L34955  
Sterile 12 x 75 mm conical
polypropylene tubes & caps		 VWR 60818-102 Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration)
12 x 75 mm round bottom
polystyrene tubes		 Becton Dickinson 21008-936  
Flow cytometer BD Bioscience FACSCalibur
LSRFortessa		 Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm)
Flow cytometer Beckman Coulter LSRII CyAn Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm)
      Laboratory Prepared
7-Aminoactinomycin D,
concentrated stock		 NA NA 1 mg/ml in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C.
7-Aminoactinomycin D,
working stock		 NA NA 100 μg/ml in PBS; prepare daily from 1 mg/ml frozen stock.
IgG block NA NA HBSS + 10 mg/ml Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/ml BSA.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).
  2. Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications. Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).
  3. Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).
  4. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  5. Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O’Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques. J. Immunol. 184, 303-314 (2010).
  6. Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties. Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).
  7. Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy. Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).
  8. Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content. Cell. 140, 62-73 (2010).
  9. Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -. J. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).
  10. Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen. J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).
  11. Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells. Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).
  12. Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF). Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).
  13. Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation. Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).
  14. Givan, A. L. A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation. Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).
  15. Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation. Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).
  16. Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution. Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).
  17. Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
  18. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry. Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).
  19. Fuse, S., Underwood, E. Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry. Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).
  20. Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111, 3546-3552 (2008).
  21. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).
  22. Roederer, M. Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian. Cytometry. 79A, 95-101 (2011).
  23. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).
  24. Houlihan, D. D., Newsome, P. N. Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease. Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).
  25. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory. T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).

タグ

Optimized StainingProliferation ModelingCell Division MonitoringCell Tracking DyesFlow CytometryImage CytometryStem CellsProgenitor CellsMembrane TransferPrecursor Cell ProliferationImmune Regulatory CellsEffector Cell FunctionCommercially Available DyesMembrane DyesProtein DyesMulticolor StudiesOptimal Use Of Dyes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image