Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Aşağıdaki protokol tek bir mikrotüp cihazın üretimi için. 1. Halloisit Nanotube Çözüm hazırlanması Sonikasyon (10-13 W (RMS)) 250 uL halloysitten nanotüp solüsyonu (su içinde ağırlıkça% 6.6) 30 sn. Bir kez soğuk su ve tekrar sonication ile serin bir çözüm. Tekrar soğutun. Bir şırınga içine sonike çözüm çizin, bir 0.45 mikron şırınga filtre takın ve temiz mikrofuge'de tüpe filtre çözüm. Homojenliği sağlamak için zaman zaman Vortex çözüm. 2. Halloisit Nanotüpler ile mikrotüp İç Yüzey Kaplama 50 cm Micro-Renathane microtubing uzun bölümü (300 mikron iç çapı, 35.3 uL iç hacmi) edinin. Diyagonal bir anda mikrotüp bir ucunu kesin ve küçük bir IDEX adaptör parça takın. Mikrotüp diğer ucunda bir 3/10 cc 29G şırınganın iğne yerleştirin. Mikrotüp temizlemek için, mikrotüp açık ucundan (ucu yerleştirmekadaptör ile)% 70 etanol ve çekilişe ~ şırıngaya 50 uL etanol mikrotüp doldurmak için. Şırıngaya distile su cömert bir hacim çizerek mikrotüp dışarı etanol durulayın. Mikrotüp gelen şırınga ayırmak, şırınga boşaltılması ve ardından mikrotüp için takın. % 0.02 su içinde a / h poli-L lisin çözeltisi hazırlayın. Mikrotüp içine 50 uL çizin ve oda sıcaklığında (RT) az 5 dakika oturup bekleyin. Mikrotüp içine 100 uL filtre nanotüp çözüm çizin ve RT az 3 dakika inkübe sağlar. Nanotüp çözüm durulama mikrotüp ile 100 uL su çizin. RT gece, su ile dolu, oturup kaplı mikrotüp izin verin. 3. Hücre İzolasyon için mikrotüplerdeki hazırlanması 1X Dulbecco fosfat içinde 10 ug / mL protein G çözeltisi hazırlayın (- 7.2 PBS, pH 7.0) tamponlu tuz. Mikrotüp ile 50 uL PBS çizin ve sonra 50 uL çekmekProtein G-solüsyonu ve oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe izin verir. 5 ug / mL E-selektin-IgG ve PBS içerisinde 50 ug / mL antikoru (en kanseri numuneler için, anti-PSMA prostat kanseri numuneler için anti-EpCAM) ihtiva eden bir solüsyon hazırlanır. Mikrotüp içine E-selektin ve antikor çözeltisi 50 uL çekecek ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe izin verir. Nonspesifik hücresel adezyon% 5 süt proteini bloke edilir. % 5 (a / h) PBS içinde süt proteini çözeltisi hazırlayın. Mikrotüp içine 50 uL süt proteini çözeltisi çekecek ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe izin verir. Tüpe 50 uL PBS çizin ve kan veya buffy coat örnekleri işlem için hazır olana kadar oda sıcaklığında bekletin. Önceden izolasyon için mikrotüp kullanılarak ila 10 dakika, selektin molekülleri aktive Ca2 + ("PBS +") ile doyurulmuş olan 50 uL PBS çizer. 4. Hücre izolasyon için örneklerinin hazırlanması Hasta heparinize içine 10 ml kan çizin veya eldetüp. 50 ml santrifüj tüpüne Yeri 10 ml Ficoll-Paque lenfosit izolasyonu çözüm. Ficoll üstüne hafifçe tabaka 10 ml tam kan, böylece kan ve Ficoll karıştırmak değil. ° C ile 4 Minimal yavaşlama azından 15 dakika süreyle 2000x g'de santrifüj;. Yeni tüp buffy coat tabakası ve yer çıkarın. PBS ile yıkama buffy coat (10 dakika 230X g de santrifüj, süpernatant atın). Yavaşça 1 ml eritrosit lizis tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri ve eritrositler lyse RT az 10 dakika inkübe edilir. 10 ml PBS, yavaşça karıştırın ve 10 dakika 230X g santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve yavaşça 4 ml PBS + için 3 pelletini. 5.. Hücre izolasyonu IDEX bağdaştırıcılar kullanılarak bir 5 mL şırıngaya fonksiyonlandırılmış mikrotüp bir ucunu. Bir şırınga pompası üzerine şırınga yerleştirin. Hücre suspensio inmeye fonksiyonlandırılmış mikrotüp açık ucundann. 1-4 mL / saat hızda mikrotüp yoluyla hücre süspansiyonu işlemek. PBS içeren bir tüpe mikrotüp açık ucuna transfer + ve mikrotüp ilişkisizleştirilir ve gevşek bağlı hücreleri çıkarmak için 0.016 ml / dk şırıngaya 300 uL PBS + çizin. Temiz bir tüp içine mikrotüp açık ucuna yerleştirin. Mikrotüp gelen şırınga çıkarın ve Accutase ile doldurulmuş bir şırınga takın. Yavaşça doldurmak için mikrotüp (~ 50 uL) içine yeterince Accutase serpmek ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe izin verir. Toplama, mikrotüp içine 1 büyüme ortamı mL (% 79 RPMI,% 20 FBS,% 1 penisilin streptomisin) ve yayma ile doldurulmuş bir şırınga takın doku kültürü içine atık plaka iyi muamele. 37 de kültüre hücreleri ° C ile nemlendirilmiş koşullar altında% 5 CO2. 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu tekniğin amacı, kanser hastalarında kan uygulanabilir kanser hücreleri izole etmek için bir. Çeşitli yöntemler kültüründe kanser hücrelerini tanımlamak için vardır; cihazın başarısı için gerekli bir doğrulama. Biz, sağlam hücre çekirdeğine (Şekil 2 ve 3) tespit etmek DAPI ek olarak, bu tür EpCAM (epitel hücre adezyon molekülü) veya PSMA (prostat spesifik membran antijeni) epitel yarımlar karşı antikorları ile kültür içinde hücreleri leke seçmiştir. Kanser hücrelerinin sayısı, bu teknik kullanılarak ille başlangıç ​​numunedeki nedenle kapalı zaman eğrileri sayısının bir fonksiyonu olduğu, ve hastanın değişkenliği yüksek olabilir yakalanır. Evre IV kanser tanısı almış hastalardan alınan numuneler işleme, biz rutin saflıklarda kan tüp başına 100 ve 500 arasında kanser hücrelerini,>% 50 yakalamak. Hemen izolasyon ardından, kontamine lökositlerin fazla sayıda mevcut olabilir. Ancak bu rakamlar kadar 5 gün için kültür ortamında aşağıdaki kuluçka tüketilmiş olacaktır. <strong> Şekil 1. antikor-aracılı statik yapışma takip selektin aracılı haddeleme gösteren CTC izolasyonu için fonksiyonlandırılmış mikrotüp şematik. Şekil 2. Kan örneklerinden CTC izolasyon Temsilcisi verileri bir meme kanseri hasta ve bir akciğer kanseri hastanın çekilen. CTC EpCAM boyama dayalı olarak tanımlanan uygulanabilir pozitif hücrelerin sayısı CTC yakalanan hücrelerin sayısı ile karşılaştırıldığında katı çubukları ve sol ordinat ve tespit edilmiştir hücrelerin yüzdesi ilgilendirmeyen ile temsil edilen açık çubuklar ile temsil edilir ve Sağ ordinat üzerinde ölçüldü. Sonuçlar kültür beş gün takip ediyoruz. Isolati ila 5 gün sonraki kültüründe CTC ayrı donör (A ve B) den Şekil 3. Örnek mikrografikleriBir kanser hastasının kan örneği üzerinde. Hücreler floresan çekirdeği (mavi) görselleştirmek için AlexaFluor 488 (yeşil) ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile EpCAM için boyandı.