Biofabrication ile Bio-Elektronik Arayüz Bridging

1. Aljinat Elektrodepozisyon Timsah klipler kullanarak patch kablo ile özel fabrikasyon elektrotlar için bir güç kaynağı bağlayın. Bir indiyum kalay oksit (ITO) cam slayt anot olarak hareket edecek (çalışan elektrotlar) ve platin folyo katot (karşı elektrot) olarak görev yapacak kaplıdır. Fonksiyonelleştirilmiş edilecek yüzey ITO karşı elektrot karşı ve bir çözelti veya depolanması çözelti yüzeyinde bulunan yatay olarak bu tür içine daldırılır üzere dikey olarak yerleştirilir, böylece elektrotlar yerleştirin. Damıtılmış su içinde% 1 ve% 0.5 aljinat CaCO 3 (ağırlıkça) karıştırılarak ve daha sonra çözelti otoklavda bir aljinat biriktirme çözeltisi hazırlayın. Sürekli kullanımda olmadığı zaman çözüm karıştırılması tavsiye edilir. Birikimi çözüm inmeye her iki elektrot. Kullanılan alginat fluoresan flüoresan için izin vermek için, hem Cheng ve ark. 14 başına, Flüorosferlerini (Invitrogen) ile etiketlenmiş edilebilirOrtaya çıkan filmin ce görüntüleme. 2 dakika boyunca sabit bir akım yoğunluğu (3 A / m 2) uygulanır; gerilimi 2-3 aralığında kayacak V. Elektrot çıkarın ve olmayan yatırılan çözüm kaldırın. Yavaşça gereksiz aljinat kaldırmak için NaCl (0.145 M) ile filmi durulayın. Jeli güçlendirmek için CaCI2 (0.1 M) içerisinde filmin kısaca (~ 1 dk) inkübe. NaCl (0.145 M) ile durulanır ve CaCl2 (1 mM) ile desteklenmiş istenen bir çözelti içinde inkübe edilir. Bir floresan mikroskop (Şekil 1B) kullanarak görüntü. 2. Alginat iletişim kurmak Hücre Populasyonlarının Codeposition LB ortamında yetişen bir sinyal gönderici hücre kültürü (W3110 wt E. coli), ve sinyal alıcı hücre kültürü (MDAI2 + pCT6-lsrR – amp r + PET-DsRed – kan r), LB ortamında yetişen + 50 mcg / mL kanamisin ve ampisilin her biri, bir gecede büyümüş olmalıdırnd 1 optik yoğunluğu ile büyüme (600 nm) için yeniden aşılandı. Kullanmadan önce LB ile 0.4-0.6 için alıcı hücre kültürü optik yoğunluğunu ayarlayın. Yarısı kadar bir yoğunluğa kadar seyreltilir hücreleri,% 1 aljinat,% 0.5 CaCO 3 arasında bir nihai konsantrasyona 1:1 oranında bir yerleştirme% 2 aljinat solüsyonu ve% 1 CaCO 3, ve her bir hücre kültürü ile karışım hazırlamak kültür yoğunluğu. Iyi bir polidimetilsiloksan (PDMS) (Sylgard talimatlarına göre hazırlanan ve istenilen büyüklükte kesilir) ve bir platin elektrot tarafından bulunan iki İTO elektrotlar desenli cam bir slayt kullanın. Prosedür 1 (aljinat elektrodepozisyon) de anlatıldığı gibi platin ile bir güç kaynağı için bir ITO elektrot bağlanır. Alıcısının hücre ihtiva eden bir çözelti içinde depolanması elektrotlar batırmak. 3 yüzey alanı boyutu tek elektrot ile tanımlanır A / m 2, bir yoğunlukta sabit bir akım besleme ayarlanır hangi deposition meydana gelecektir. Aljinat matris içinde hücrelerinin codeposition için izin vermek üzere 2 saat için mevcut geçerlidir. Basamak 1.5 'de tarif edildiği gibi filmin çalkalayın. Ikinci, bitişik, İTO elektrot için anodik bağlantı açın. Çökelme işlemi (Adımlar 2,4-2,7) tekrarlayın, ancak bu sefer gönderici hücreleri içeren çözüm tanıtılması. 37 'de bir gece codeposited hücreleri ve kalsiyum-aljinat içeren 2-elektrot çip ° C'de inkübe fosfat salin (PBS) ile% 10 LB ortamı ve 1 mM CaCI2 ile desteklenmiş tamponlu. Sonra bir floresan mikroskop (Şekil 2B) kullanan inkübasyon, görüntü. 3. Chitosan Elektrodepozisyon Timsah klipler aracılığıyla elektrotlar için güç kaynağı bağlayın. Bir altın kaplamalı silikon çip katot (elektrot çalışma) olarak hareket edecek ve bir platin folyo anot (karşı elektrot) olarak görev yapacak. Altın elektrot yüzeyine yerleştirin böylece thazından bir elektrot karşı koyar ve hem de bir solüsyon veya depolanması çözelti yüzeyinde bulunan yatay olarak bu tür içine daldırılır edilmesi ya da dikey olarak yerleştirilirler. Suya kitosan gevreği karıştırarak bir kitosan çözeltisi hazırlayın ve yavaş yavaş M HCl Meyer ve ark. 15 tarafından açıklanan işlemleri emin olarak, polisakkaritler (nihai pH 5.6) eritmek için 2 ekledi. Tamamen tevdi edilmesi için arzu edilen bölgeye daldırarak, kitosan, bir solüsyonu (% 0.8) içine elektrotlar yerleştirin. Kitosan kullanılan floresan 5 ile sokulabileceği – (ve-6)-carboxyrhodamine 6G süksinimidil ester (Invitrogen), Wu ve ark göre 8, floresan mikroskop ile görüntü elektrobirikimli film.. 2 dakika boyunca sabit bir akım yoğunluğu (4 A / m 2) uygulayın. Voltaj 2-3 aralığında kaydırmaya V. depositio maruz çalışan elektrot arasında altın yüzey alanı bir fonksiyonu olarak akım yoğunluğu hesaplarn çözüm. Gereksiz kitosan kaldırmak için DI su ile elektrot durulayın. Çip su veya PBS (10 mM, pH 7,0) içinde depolanabilir. Bir floresan mikroskop (Şekil 3C) kullanarak görüntü. 4. Bir Fonksiyonlu Kitosan Film ile Elektrokimyasal İletimi 4 bir akım yoğunluğu Prosedür 3 (kitosan elektrodepozisyon) 'e göre bir model verilmiş elektrot üzerine A / m 2 azından bir çözelti (% 1 kitosan, 680 U / mL Gox, pH 5,6) ile Codeposit kitosan ve glukoz oksidaz (Gox). Gox içinde sıkışıp kalan bir kitosan filmi oluşturulur. Çalışan elektrot, karşı elektrot ve Ag / Şekil 4A'da anlatıldığı gibi AgCİ referans elektrotu gibi bir platin tel gibi bir üç-elektrot sistemine muamele elektrot takın. NaCl (0,1 M) ihtiva eden bir fosfat tampon solüsyonu (0.1 M, pH 7.0) içine batırmak elektrotlar. Elektrokimyasal kitosan için protein konjugekronoamperometri 10 ile 60'lar için sabit voltaj (0.9 V) uygulayarak filmi. Fosfat tamponu içinde çip (0.1 M, pH 7.0) yerleştirilir ve tepkimeye girmemiş NaCl ve konjuge olmayan Gox kaldırmak için bir orbital karıştırma cihazı üzerinde, 10 dakika boyunca yıkanır. 5 mM glukoz çözeltisi içine batırmak adım 4.2 ve tarif edildiği gibi üç elektrot sistemi için yeniden takın. Voltametri kullanarak, 0,7 olumlu yönde potansiyel süpürüp V. süpürme görülen oksitlenme miktarı (Şekil 4B) için bir karşılaştırma olarak hiçbir glukoz oksidaz içeren bir denetim film kullanın. Glikoz çözeltisi ile elektrot kaldırmak ve fosfat tamponu (0.1 M, pH 7.0) ile daha sonra durulama fosfat tampon 8 mL (0.1 M, pH 7.0) ihtiva eden bir 10 mL behere elektrotlar yerleştirin. Önyargı 0.6 V Gox-fonksiyonlandırılmış çip çalışan elektrot (Şekil 4C) olarak hizmet vermektedir. (Her tablet ile glikoz konsantrasyonu artırır tampon glikozun alikotları ekle4 mM). Gox-fonksiyonlandırılmış kitosan film için kararlı durum akım ve glukoz konsantrasyonu arasında standart bir eğri oluşturur. 5.. Enzimatik Meclisi Kullanımı Protein fonksiyonlandırmalar Bir PDMS de içinde bulunan bitişik bir altın ve İTO elektrot ile desenli cam bir slayt kullanın. Daha önce gösterildiği gibi kitosan electrodeposit bir katodik potansiyeli olan Bias altın elektrot. Pipet ile daha sonra DI su ve PBS kısaca filmi durulayın. Floresan "AI-2 Sentaz" 16 (a DyLight etiketleme kiti kullanılarak) PBS ile + 100 U / mL tirosinaz mavi etiketli 3 uM'lik bir solüsyonu eklenir. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe, sonra PBS ile filmin durulanır. Alıcı hücreler (gibi adımlar 2.1-2.2 hazırlanan) içeren bir aljinat birikimi çözüm codeposit için İTO elektrot bir anodik potansiyel uygulayın. Prosedür 2 2.3-2.6 (aljinat hücre popülasyonlarının Codeposition) adımları izleyin. Üretmek içiniletilen sinyali (AI-2) enzimatik olarak, durulamadan sonra filmlerin% 10 LB ortamı ve 1 mM CaCI2 ile desteklenmiş PBS ile 500 uM S-adenozil homosistein (kan) içindeki bir çözeltisine, ekleyin. Çözeltinin buharlaştırılması önlemek ve 37, bir gece boyunca inkübe için elektrotlar kapsamaktadır ° C. Bu bir kırmızı floresan proteini (DsRed) oluşturarak bir alıcı hücre yanıtı için izin verecektir. Komşu elektrotlar codeposited alıcı hücreler (Şekil 5B) tarafından ifade edilen AI-2 Sentaz ve kırmızı floresan mavi floresan yakalamak için filtreler ayarlayarak floresan mikroskobu ile görüntülenebilir olabilir. 6. Temsilcisi Sonuçlar Uygulanan elektrik sinyalleri bir elektrot yüzeyi ve bu uyaranların gibi elektrot yüzeyinde bir hidrojel film olarak yatırmak aljinat ve kitosan gibi polisakkaritlerin kendinden montaj tetikleyebilir yakın lokalize mikroçevrelerde (örneğin, alanlar ve degradeler) oluşturabilirsiniz. Çünkü tOnun sol-jel geçiş elektrot yüzeyinde, ortaya çıkan filmin elektrot desen (Şekil 1B, 3C) eşleşen geometrisi ile, electroaddressed için oluşur. Böyle aljinat ve kitosan gibi Biyouyumlu filmleri biyolojik bileşenleri ile fonksiyonelleştirilmiş edilebilir yüzeyler sağlar. Aljinat kullanarak, benzersiz hücre popülasyonlarının ayrı adreslerde codeposited edilmiştir. Kendi electroaddressment kanıtı gönderici ve alıcı hücre popülasyonu arasındaki etkileşimi üzerine gözlenmektedir. Gönderenden gelen hücre ve molekül Otoendüktörün-2 (AI-2) yayılır DsRed kırmızı floresan proteini (Şekil 2A) ifade sonuçlanan alıcı hücreler tarafından alınır. Şekil 2B, kırmızı floresans sadece alıcıları ele alınmaktadır elektrot gözlenmektedir. Kitosan mevcut amin gruplarının elektrodepozisyon gibi fonksiyonlandırmalar için uygun bir yüzey için gerekli olan pH yanıt sağlamamıştır. Bizelektrokimyasal kitosan filmlerin elektrobirikimli için biyoalgı enzim glukoz oksidaz (Gox) conjugating bu eşsiz özellikleri kullanılmıştır. Bu enzim sonra sonra elektrokimyasal bir çıkış akımı üretmek için okside olabilen hidrojen peroksit üreten bir enzimatik reaksiyon (Şekil 4A) aracılığıyla glukoz tayini için yeteneği sağlar. Gox herhangi Gox ihtiva edenler filmler karşıt olarak glukoz varlığında güçlü bir anodik sinyal üretmek elektrokimyasal olarak konjuge olmuştur filmler içinde olduğunu gösterir, bu sayede, bir kimyasal sinyali elektriksel. Şekil 4B için transdük edilebilir. Bu sonuçlar Gox bir tevdi kitosan film üzerine monte edilebilir ve katalitik aktivite sürdürecek göstermektedir. Bundan başka, Şekil 4C artan glukoz konsantrasyonu karşılık olarak üretilen anodik akımı içinde bir adım artış gösterir. Şekil 4C de mevcut standart eğri adım artışlar yakın doğrusal Haldun'un ilerledi gösterirglikoz miktarına bağlıdır hion eklendi. Bu sonuçlar, aynı zamanda enzim kitosan filmin üzerine konjugasyon glukoz konsantrasyonu artan duyarlılığı muhafaza olduğunu göstermektedir. Bu, daha önce Meyer ve çalışmalarında bu sistem için karakterize edildiği gibi tespit alt limit burada çalışılmamıştır. ark. Ayrıca, bir enzimatik olarak kontrollü bir şekilde kitosan için özel bir penta-tirozin etiketi içerir için tasarlanmış, ilgilenilen bir enzim kovalent immobilizasyon, göstermiştir. Spesifik olarak, bu işlem enzim tirosinaz aracılık etmektedir. Şekil 5A yılında şeması (üst), bir enzim tarafından görüldüğü gibi, AI-2 Sentaz bir penta-tirozin etiketi içerir. Tirozinaz sonra kovalent kitosan Kullanıcı aminler bağlamak O-kinonlar için artıkları 'fenol grupları oksitleyici, tirozin etiketi üzerinde hareket eder. Tirozinaz meclis tarafından AI-2 Sentaz ile kitosan filmi fonksiyonlandırmalar kanıtı Şekil 5B görülmektedir </stAI-2 Sentaz floresan mavi etiketli olmuştur rong>. AI-2 Sentaz gönderenden hücreleri gibi aynı şekilde substrat S-adenozil homosistein (kan) den AI-2 üretir, çünkü, SAK'ın varlığında codeposited alıcısının hücre yakınlığı da floresan DsRed ifade ile cevap alıcısının hücre neden (Şekil 5A (alt)). Alıcısının hücre kırmızı flöresanlı (Şekil 5B) tekrar birinden diğerine AI-2 difüzyon nedeniyle adresler arasındaki etkileşimi gösterir, ve daha da enzimleri kitosan kez kovalent bağlanmış etkinliğini korudukları immobilize olduğunu gösterir. 1. Aljinatta elektrodepozisyon Şekil. Aljinat elektrodepozisyon (A) mekanizması: bir elektrot anodically yanlı gibi, su elektroliz lokalize bir düşük pH getirici, yüzeyi meydana gelir. Kalsiyum karbonat partikülleri fazlası ile reaksiyonaproton, kalsiyum katyonları salgılatıcı partiküller olarak çözülür. Aljinat polimer zincirleri varlığında, iyonları elektrod bir çapraz bağlı hidrojel oluşturan, bir "eggbox" ağ şelatlanmış olur. Elektrot artar mesafe olarak, aljinat, kalsiyum iyonlarının indirgenmiş varlığı nedeniyle çözelti içinde kalmasını daha büyük bir eğilim sahiptir. (B) bir L-şekilli desenli ITO elektrot electrodeposit aljinat için kullanıldı. A PDMS de yeşil bir floresan-etiketli aljinat (% 1) ve CaCO 3 (% 0.5) çökelme solüsyonu içeren elektrot ile tespit edildi. 2 dakika süreyle electrodepositing sonra. 3A / m 2 akım yoğunluğunda, electroaddressed aljinat hidrojel floresan mikroskop ile görüntülendi. Şekil 2. Hücre popülasyonlarının Codeposition. İki E. arasındaki (A) 'Şema gösteren bir etkileşim coli: Bir toplumun Otoendüktörün-2 üreten (AI-2), Bir sinyalleşme molekülü, ve "AI-2 gönderenden." Olarak adlandırılmaktadır Diğer nüfus olarak adlandırılan "AI-2 alıcı," AI-2 bir muhabir; gönderenden gelen difüzyon ile AI-2 aldıktan sonra, o kırmızı floresan proteini DsRed ifade eder. (B) AI-2 gönderenin nüfusa sahip elektrot çifti Kırmızı floresan görüntü sol elektrot üzerinde aljinat ile codeposited ve AI-2 alıcı nüfus sağ elektrot üzerinde aljinat ile codeposited. Büyütülmüş görünüm yalnızca AI-2 alıcıları DsRed ifadesi gösteriyor. Şekil 3. Kitosan elektrodepozisyon. (A) Şema kitosan, pH değerine bağımlı elektrodepozisyon gösteren. Bir cathodically önyargılı elektrot su elektroliz bu bölgede chitosanın sol-jel geçiş uyarır yerelleştirilmiş bir yüksek pH (mikrograflarında katot yakınında pH indikatörü boya yerelleştirilmiş bir renk değişimi ile gösterilir) neden olur. (B) aminler kitosana sunmak i vermekt pH duyarlı özellikleri. 6.3 (chitosanın pKa) pH Üstü aminler onun protonlanmış çözünebilir formdaki onun çözünmeyen jel formunda bir geçişi kolaylaştırmak, deprotonated edilir. (C) desenli bir altın elektrot electrodeposit kitosan için kullanıldı. Güç kaynağına cathodically bağlı elektrot, yeşil bir kitosan (% 0.8) birikimi çözüm floresan etiketli batırılır edildi. 2 dakika süreyle electrodepositing sonra. 4 A / m 2 akım yoğunluğunda, electroaddressed kitosan filmi floresan mikroskop ile görüntülendi. Bir fonksiyonlandırılmış kitosan film ile Şekil 4. Elektrokimyasal iletimi. (A) şematik bir üç elektrotlu sistem set-up gösteren. Fonksiyonlandırılmış kitosan filmin çalışan elektrot, referans elektrotu olarak elektrot ve Ag / AgCI gibi bir platin tel olarak hizmet eder. Th ile glikoz gelirlerinin Elektrokimyasal iletimiüretilen hidrojen peroksit çalışma elektrotta okside ve tespit edilebilir olduğu gösterilmiştir e enzimatik ve elektrokimyasal reaksiyon. (B) elektrokimyasal olarak konjuge glukoz oksidaz (Gox) ihtiva eden bir film ile kitosan elektrotta Siklik voltammagram (KV), 5 mM glikoz çözeltisi içinde anodik kuvvetli bir sinyal gösterir. Hiçbir Gox içeren bir film, bir kontrol olarak görev yaptı ve aynı çözüm hiçbir sinyal görünür. (C) anodik akım ve glukoz konsantrasyonu arasında standart eğri yakın bir doğrusal ilişki (Her tablet 4 mM glukoz konsantrasyonu artmış ve ayrıca kademeli bir şekilde ilave grafikte geçerli genliği artış) görüntüler. Şekil 5. Enzimatik derleme kullanarak Protein fonksiyonlandırmalar. Tirozin etiketli gösteren (A, üst) Programı "AI-2 Sentaz" kovalent tirozinaz meclisi tarafından bir kitosan film mecburiyetinden. Tirozin kalıntıları oksit halinetirosinaz eylemiyle O-kinonlar için ized ve kovalent bir bağ oluşturan, kitosan film üzerine amin grubu ile reaksiyona girebilir. (A, alt) AI-2 Sentaz substrat (SAK) AI-2 üretir; alıcı hücreler DsRed floresan ifade tarafından oluşturulan AI-2 rapor. (B) altın bir kitosan filmi gösteren Floresans görüntüler, mavi etiketli AI-2 Sentaz ile fonksiyonelleştirilmiş. Adjacently, AI-2 alıcı hücreleri İTO üzerinde aljinat ile codeposited edilir. İyi ve inkübasyon için enzimatik substrat ilave edildikten sonra, AI-2 alıcısı hücreleri DsRed ifade eder.