Colmatar a interface Bio-eletrônico com Biofabrication

1. Eletrodeposição de alginato Conecte uma fonte de alimentação para os eletrodos fabricados sob medida através de patch cords utilizando jacaré. Um óxido de estanho índio (ITO) coberto lâmina de vidro irá atuar como o ânodo (eletrodo de trabalho) e folha de platina servirá como catodo (contra-eletrodo). Posicionar os eléctrodos de modo a superfície de ITO para ser funcionalizada se opõe ao contra-eléctrodo e está posicionado verticalmente para ser mergulhada em uma solução ou horizontalmente de modo que a solução de deposição está contido na superfície. Preparar uma solução de alginato de deposição através da mistura de alginato de 1% e 0,5% CaCO 3 (em peso) em água destilada e, em seguida, a autoclavagem a solução. Recomenda-se a agitar a solução continuamente quando não em uso. Submergir os dois eléctrodos para a solução de deposição. O alginato utilizado pode ser marcado por fluorescência com Fluoroesferas (Invitrogen), como por Cheng et al. 14, para permitir fluorescence formação de imagens do filme resultante. Aplicar uma densidade de corrente constante (3 A / m 2) durante 2 minutos; tensão irá deslocar dentro da gama de 2-3 V. Desligue o eléctrodo e remover a solução não depositadas. Suavemente enxaguar o filme com NaCl (0,145 M) para remover alginato supérflua. Incubar a brevemente película (~ min 1) em CaCl2 (0,1 M) para reforçar o gel. Lavar com NaCl (0,145 M) e incubar em uma solução desejada suplementado com CaCl2 (1 mM). Imagem utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 1B). 2. Codeposição de populações de células comunicantes em alginato A cultura de células sinal remetente (W3110 Escherichia coli em peso), cultivados em meio LB, e uma cultura de células sinal do receptor-(MDAI2 + pCT6-LSRR – amp r + pET-dsRed – kan r), cultivados em meio LB + 50 ug / ml cada de canamicina e ampicilina, deve ser crescido durante a noite umand re-inoculado para o crescimento até uma densidade óptica (a 600 nm) de 1. Ajustar a densidade óptica da cultura de células receptor para 0,4-0,6 com LB antes da utilização. Prepara-se uma solução de deposição de alginato a 2% e 1% de CaCO 3, e misturar com cada cultura de células em uma proporção de 1:1 para uma concentração final de alginato de 1%, 0,5% de CaCO 3, com as células diluídas para uma densidade de cerca de meia a densidade de cultura. Usar uma lâmina de vidro modelado com dois eléctrodos de ITO contidos por um polidimetilsiloxano (PDMS) bem (preparado de acordo com as instruções Sylgard e cortado no tamanho desejado) e um contra-eléctrodo de platina. Ligue um eléctrodo ITO a uma fonte de alimentação com a platina como descrito no Processo 1 (electrodeposição alginato). Mergulhar os eléctrodos em uma solução de deposição contendo as células do receptor. Ajuste o fornecimento de energia para uma corrente constante a uma densidade de 3 A / m 2, onde a dimensão área de superfície é definida pela único eléctrodo em que Deposition vai ocorrer. Aplicar a corrente durante 2 minutos para permitir a codeposição das células na matriz de alginato. Lavar o filme, tal como descrito no Passo 1,5. Mude a conexão anódica para o segundo, eletrodo, adjacente ITO. Repetir o procedimento de deposição (Passos 2,4 – 2,7), mas desta vez a introdução da solução contendo as células de remetente. Incubar o chip 2-eléctrodo contendo células codeposited e de alginato de cálcio durante a noite a-37 ° C em tampão fosfato salino (PBS) suplementado com meio LB a 10% e 1 mM de CaCl2. Após incubação da imagem, utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 2B). 3. Eletrodeposição Chitosan Conecte a fonte de alimentação para os eletrodos através jacaré. Um chip de silício revestido de ouro irá atuar como o catodo (eletrodo de trabalho) e uma folha de platina servirá como o ânodo (contra-eletrodo). Posicione a superfície do eletrodo de ouro, de modo ªem que se opõe ao contra-eléctrodo e ambos estão posicionados verticalmente para ser mergulhada em uma solução ou horizontalmente de modo que a solução de deposição está contido na superfície. Prepara-se uma solução de quitosano por mistura de quitosano flocos em água e adicionando lentamente HCl 2 M para dissolver os polissacarídeos (pH final 5,6), certificando-se a seguir o procedimento descrito por Meyer et al. 15. Colocar os eléctrodos em uma solução de quitosano (0,8%), completamente submergindo a área desejada para a deposição. A quitosana utilizada pode ser marcado por fluorescência com 5 – (e-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidil éster (Invitrogen), como por Wu et al 8, para a imagem da película electricamente por microscopia de fluorescência.. Aplicar uma densidade de corrente constante (4 A / m 2) durante 2 minutos. Voltagem irá deslocar dentro da gama de 2-3 V. Calcular a densidade de corrente como uma função da área de superfície de ouro do eléctrodo de trabalho exposto ao Depositiosolução de n. Lavar o eléctrodo com água DI para remover supérfluo quitosana. O chip pode ser armazenado em água ou PBS (10 mM, pH 7,0). Imagem utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 3C). 4. Eletroquímica Transdução com um filme de quitosana funcionalizada Codeposit oxidase de quitosano e glicose (GOx) de uma solução (1% de quitosano, 680 U / mL GOx, pH 5,6) com uma densidade de corrente de 4 A / m 2 para um eléctrodo modelado de acordo com o Procedimento 3 (electrodeposição quitosana). Uma película de quitosano aprisionado em GOx será gerado. Anexar o eléctrodo tratada para um sistema de eléctrodos de três como o eléctrodo de trabalho, um fio de platina como o contra-eléctrodo e Ag / AgCl como o eléctrodo de referência, tal como descrito na Figura 4A. Mergulhar os eléctrodos em uma solução tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,0) contendo NaCl (0,1 M). Electroquimicamente conjugar a proteína para a quitosanapelícula através da aplicação de uma tensão constante (0,9 V) por 60s usando cronoamperometria 10. Colocar o chip em tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,0) e lava-se durante 10 minutos num agitador orbital para remover qualquer GOx que não reagiu de NaCl e não conjugado. Voltar a ligar para o sistema de eléctrodo de três conforme descrito no passo 4,2 e imerso numa solução de glucose a 5 mM. Usando voltametria cíclica, varrer o potencial numa direcção positiva para 0,7 V. Use uma película de controlo não contendo oxidase de glicose como uma comparação para a quantidade de oxidação visto na varrimento (Figura 4B). Remover os eléctrodos a partir da solução de glucose e lavar com tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,0), em seguida, se os eléctrodos para um copo de 10 ml contendo 8 ml de tampão fosfato (0,1 M, pH 7,0). Viés o chip GOx-funcionalizado a 0,6 V para servir como o eléctrodo de trabalho (Figura 4C). Adicionar alíquotas de glicose para o tampão (cada alíquota aumenta a concentração de glucose por4 mM). Gerar uma curva padrão entre a corrente de estado estacionário ea concentração de glucose para o filme de quitosano GOx-funcionalizado. 5. Funcionalização proteína enzimática usando assembly Usar uma lâmina de vidro modelado com uma ouro adjacente e eléctrodo ITO contido dentro de um poço PDMS. Polarização do eletrodo de ouro com um potencial catódico para electrodeposit quitosana como mostrado anteriormente. Lavar filme brevemente em água Dl e, em seguida, PBS, com uma pipeta. Adicionar uma solução de 3 uM azul fluorescente etiquetado "Sintase AI-2" 16 (usando um kit de rotulagem DyLight) + 100 U / mL de tirosinase em PBS. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente, em seguida, lavar o filme com PBS. Aplicar um potencial anódico para o eléctrodo ITO para codeposit uma solução de deposição de alginato contendo células de receptor (tal como preparado no passos 2.1-2.2). Siga os passos de 2,3-2,6 de Processo 2 (codeposição de populações de células em alginato). Para geraro sinal transmitido (AI-2) enzimaticamente, após enxaguamento dos filmes adicionar uma solução de 500 uM de homocisteína S-adenosil-(HAS) em PBS suplementado com 10% LB meios de comunicação e CaCl 1 mM 2. Cobrir os eléctrodos, para evitar a evaporação da solução e incubar durante a noite a 37 ° C. Isto irá permitir a uma resposta de células receptor através da geração de uma proteína fluorescente vermelha (dsRed). Eléctrodos adjacentes podem ser trabalhada com microscopia de fluorescência, ajustando os filtros para capturar a fluorescência azul do Sintase AI-2 e fluorescência vermelha expressos pelas células do receptor codeposited (Figura 5B). 6. Os resultados representativos Impostas sinais eléctricos pode criar microambientes localizadas (por exemplo, campos e gradientes) perto de uma superfície do eléctrodo e estes estímulos pode desencadear a auto-montagem de polissacáridos tais como alginato e quitosana para depositar como uma película de hidrogel na superfície do eléctrodo. Porque ta sua transição sol-gel ocorre na superfície do eléctrodo, o filme resultante é electroaddressed, com a sua geometria correspondente ao padrão de eléctrodo (Figuras 1B, 3C). Filmes biocompatíveis tais como alginato e quitosano proporcionar superfícies que podem ser funcionalizados com componentes biológicos. Usando alginato, as populações de células únicas foram codeposited em endereços separados. Prova da sua electroaddressment é observada na interação entre o emissor eo receptor população de células. A molécula autoinducer-2 (AI-2) difunde-se a partir das células remetente e é absorvido pelas células do receptor, resultando na expressão da proteína de vermelho dsRed fluorescente (Figura 2A). Na Figura 2B, fluorescência vermelha é observado apenas no eléctrodo onde os receptores são tratados. Os grupos amina presentes na quitosana fornecê-lo com a capacidade de resposta pH requerido para a electrodeposição, bem como uma superfície adequada para funcionalização. Nósutilizaram estas propriedades únicas por electroquimicamente conjugando a glicose oxidase biosensoriamento enzima (GOx) para electrodepositados quitosano filmes. Esta enzima, em seguida, fornece a capacidade para a detecção de glucose através de uma reacção enzimática (Figura 4A) produção de peróxido de hidrogénio que pode então ser oxidado para produzir electroquimicamente uma corrente de saída. Desta forma, um sinal químico pode ser transduzida para Figura eléctrica. 4B mostra que os filmes em que GOx foi electroquimicamente conjugado produzir um sinal forte anódico na presença de glicose, em oposição a estas películas não contendo GOx. Estes resultados indicam GOx pode ser montado sobre uma película de quitosano depositados e irá reter a actividade catalítica. Além disso, a Figura 4C mostra um passo no aumento-corrente anódica produzida em resposta a concentrações de glicose crescentes. A curva padrão também presente na Figura 4C mostra que os aumentos passo-prosseguiu em uma fas quase linearhion dependente da quantidade de glucose adicionada. Estes resultados mostram que a enzima também retém a sua sensibilidade para aumentar as concentrações de glucose em cima de conjugação com o filme de quitosano. O limite inferior de detecção não foi estudada aqui como foi anteriormente caracterizados para este sistema na obra de Meyer et. ai. Nós também têm demonstrado a imobilização covalente de uma enzima de interesse, engenharia para conter uma marca de penta-tirosina personalizado, a quitosana de uma forma enzimaticamente controlada. Especificamente, este processo é mediado pela enzima tirosinase. Como representado pelo esquema na Figura 5A (superior), uma enzima, AI-2 Sintase inclui uma marca penta-tirosina. Tirosinase actua sobre a marca de tirosina, oxidando os resíduos dos grupos de fenol a O-quinonas, que então covalentemente se ligam a aminas de quitosano de. Evidência de quitosano funcionalização película com a Sintase AI-2 por tirosinase montagem é observado na Figura 5B </strong>, onde a Sintase AI-2 foi marcado por fluorescência azul. Devido AI-2 Sintase gera AI-2 a partir do substrato S-adenosil-homocisteína (HAS), da mesma forma como as células de remetente, a sua proximidade com as células do receptor codeposited na presença de HSA também faz com que as células receptoras para responder fluorescentemente expressando dsRed (Figura 5A (inferior)). Fluorescência vermelha das células do receptor (Figura 5B) demonstra novamente interacção entre os endereços devido à difusão de AI-2 a partir de um para o outro, e indica ainda que as enzimas imobilizadas para quitosano mantenham a actividade de uma vez ligado covalentemente. Figura 1. Electrodeposição alginato. (A) Mecanismo de electrodeposição alginato: Como um eléctrodo é anodicamente enviesada, a electrólise da água ocorre na sua superfície, gerando um pH baixo localizada. Partículas de carbonato de cálcio reagem com o excedentede protões, libertando catiões de cálcio como as partículas se dissolvem. Na presença de cadeias de polímero de alginato, os iões tornam-se quelatado em um "eggbox" rede, formando um hidrogel reticulado no eléctrodo. À medida que a distância a partir dos aumentos de eléctrodos, alginato tem uma maior tendência para permanecer em solução, devido à presença reduzida de iões de cálcio. (B) Uma forma de L modelado eléctrodo ITO foi utilizado para alginato electrodeposit. Um PDMS poço foi fixada ao eléctrodo para conter um alginato verde fluorescentemente marcado com (1%) e CaCO 3 (0,5%) de solução de deposição. Após eletrodeposição durante 2 min. a uma densidade de corrente de 3A / m 2, o hidrogel de alginato electroaddressed foi fotografada por microscopia de fluorescência. Figura 2. Codeposição de populações de células. (A) Esquema mostrando a interação entre dois E. cepas de Escherichia: Uma população produz autoinducer-2 (AI-2), Uma molécula de sinalização, e é denominado "remetente AI-2." A outra população, chamada de "receptor AI-2," é um repórter do AI-2; após o recebimento do AI-2 pela difusão do remetente, que expressa a proteína fluorescente vermelha dsRed. (B) Red imagem da fluorescência de par de eletrodos com a população AI-2 remetente codeposited com alginato no eletrodo à esquerda e AI-2 receptor população codeposited com alginato sobre um eletrodo de direito. Vista ampliada mostrando a expressão dsRed de apenas os receptores AI-2. Figura 3. Electrodeposição quitosana. (A) Esquema mostrando a electrodeposição dependente do pH do quitosano. Electrólise água a um eléctrodo de catodicamente enviesada faz com que um pH localizada elevada (mostrada por uma mudança de cor localizada de um corante indicador de pH próximo do cátodo na micrografia), que estimula a transição sol-gel de quitosano nesta região. (B) As aminas apresentar em quitosana dar it pH responsivos propriedades. Acima de um pH de 6,3 (pKa do quitosano) as aminas são desprotonados, facilitando uma transição a partir da sua forma protonada solúvel para a sua forma de gel insolúvel. (C) Um eléctrodo de ouro modelado foi utilizado para electrodeposit quitosano. O eléctrodo, ligado catodicamente à fonte de alimentação, foi imerso em um verde fluorescente marcada com quitosana (0,8%) de solução de deposição. Após eletrodeposição durante 2 min. a uma densidade de corrente de 4 A / m 2, o filme de quitosano electroaddressed foi fotografada por microscopia de fluorescência. Figura 4. Transdução Electrochemical com uma película de quitosano funcionalizado. (A) esquemático, mostrando a configuração de um sistema de eléctrodo três. Película de quitosano funcionalizado serve como eléctrodo de trabalho, um fio de platina como o eléctrodo contador e Ag / AgCl como o eléctrodo de referência. Eletroquímica transdução das receitas de glicose através ªelectrónicos reacções enzimáticas e electroquímico mostrados onde o peróxido de hidrogénio produzido pode ser oxidado e detectado no eléctrodo de trabalho. (B) Cyclic voltammagram (CV) com eléctrodo com uma película contendo quitosana da glicose-oxidase electroquimicamente conjugado (GOx) mostra um sinal forte anódica em uma solução de glicose 5 mM. Uma película contendo nenhum GOx serviu como um controlo e exibido nenhum sinal na mesma solução. (C) Uma curva padrão entre a corrente anódica e da concentração de glucose apresenta uma relação quase linear (cada alíquota aumentou a concentração de glicose por 4 mM e também aumentou a amplitude da corrente no gráfico de inserção de uma forma passo a passo). Figura 5. Funcionalização proteína utilizando montagem enzimática. (A, superior) Esquema mostrando-tirosina com a tag "AI-2 Sintase" sendo covalentemente ligado a um filme de quitosana por montagem tirosinase. Os resíduos de tirosina-se óxidozada a O-quinonas por acção da tirosinase e pode reagir com grupos amina sobre o filme de quitosano, formando uma ligação covalente. (A, inferior) A Sintase AI-2 gera AI-2 a partir de um substrato (HAS), as células do receptor relatar o gerado AI-2 por expressão de fluorescência dsRed. (B) imagens de fluorescência mostrando um filme de quitosana em ouro, funcionalizadas com azul marcado Sintase AI-2. Adjacente, AI-2 células receptoras são codeposited com alginato sobre ITO. Após a adição do substrato enzimático para o poço e incubação, as células AI-2 receptor expresso dsRed.